宏基因组二代测序在儿童内脏利什曼病相关噬血淋巴组织细胞增生症中的应用价值

康 磊 郭 芳 李立方 白新凤 程彩云 徐梅先

河北省儿童医院 1.重症监护科，2.感染科（河北石家庄 050031）

噬血淋巴组织细胞增生症（hemophagocytic lymphohistiocytosis，HLH）是由淋巴细胞和巨噬细胞过度激活增殖引起的大量炎症因子释放的临床病理状态[1]。HLH 分原发性和继发性，感染相关HLH是继发性HLH最常见的形式[2]，利什曼原虫是常见的触发HLH 的原生动物[3]。继发于内脏利什曼病（visceral leishmaniasis，VL）的HLH 在儿童时期非常罕见，若不能早期诊断治疗病死率可达100%[4]。利什曼原虫的鉴定是诊断VL-HLH 的关键，而传统方法具有局限性[5]，如骨髓穿刺（bone marrow aspiration，BMA）及淋巴结、脾脏穿刺液镜检，阳性率低且很大程度上依赖于检验人员的经验；而免疫层析法快速检测存在滞后性，容易漏诊或误诊，延误治疗，影响预后。宏基因组二代测序（metagenomics next generation sequencing，mNGS）可以同时检测多个病原体基因序列，实现病原全面无偏差筛查。现报道6 例VL-HLH 患儿的诊断和治疗经验，探讨二代测序技术在VL-HLH中的应用价值。

1 对象与方法

1.1 研究对象

回顾性分析2016年1月1日至2022年6月30日确诊的VL-HLH 患儿的临床资料。纳入标准：①年龄＜18岁；②符合HLH-2004诊断标准[6]；③BMA检出利什曼原虫或二代测序检出利什曼原虫基因序列；④抗利什曼原虫治疗有效。排除标准：①先天性HLH；②已明确为EB 病毒等其他常见病原感染所致的继发性HLH；③自身免疫性疾病及肿瘤性疾病所致的继发性HLH。根据VL-HLH的确诊方式不同分为mNGS组及BMA组。

本研究获得医院医学伦理委员会批准通过（No.2018013）。

1.2 方法

1.2.1 临床资料收集 包括性别、年龄、居住城市、疫区旅居史、首次住院时间、住院次数、确诊方式、诊断延迟天数、临床表现和预后等。

1.2.2 常规实验室检测 包括血生化、凝血四项、铁蛋白、总淋巴细胞免疫分析、免疫球蛋白定量、可溶性CD25（sCD25），HLH相关遗传基因，细菌、真菌培养，EB 病毒、巨细胞病毒抗体及聚合酶链反应（PCR），1,3-β-D葡聚糖试验及半乳甘露聚糖试验，多重PCR 检测肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、耐甲氧西林葡萄球菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌、流感嗜血杆菌、嗜肺军团菌、结核分枝杆菌复合群、肺炎支原体、肺炎衣原体及流感病毒、腺病毒、博卡病毒、偏肺病毒、冠状病毒。所有研究对象均进行BMA，获取骨髓0.2 mL涂片进行形态学检测，2 mL进行骨髓细菌及真菌培养。入组病例未行脾脏及淋巴结活检，未行免疫层析法快速检测等血清学检测。

1.2.3 宏基因组二代测序 送检标本均符合华大基因要求，使用BGISEQ-50/MGISEQ-2000平台，对样本中微生物核酸序列进行分析，通过与数据库中已有微生物的核酸序列进行比对，从而对微生物进行鉴定。检测过程包括核酸提取、RNA逆转录、文库构建、测序、信息分析及报告解读。

1.3 统计学分析

采用SPSS 22.0 统计软件进行数据分析。非正态分布的计量资料以中位数M（P25～P75）或中位数（全距）表示。计数资料以例数（百分比）表示。

2 结果

2.1 临床资料

河北省儿童医院2016 年之前无VL-HLH 确诊病例；2016年1月至2022年6月共收治住院患儿31 048例，确诊VL-HLH6例（表1），患病率为0.02%。其中男4例、女2例，中位年龄20.0（9.8～27.0）月。病初均否认利什曼原虫疫区旅居史，病例P1、P2、P5 在确诊VL-HLH 后追问病史，谓半年前有山西省阳泉市旅居史。夏季起病1 例、秋季起病2 例、冬季起病3 例，从发病至确诊的诊断延迟天数为38.0（27.3～69.0）天，3 例未能在首次住院期间确诊。6例于住院初始留取血标本送检常规实验室检查均无致病微生物检出，HLH相关遗传基因检查无阳性发现。6 例均有发热、脾大、血细胞减少、铁蛋白增高，5例合并高三酰甘油血症或低纤维蛋白原血症，4例NK细胞活性下降，3例sCD25升高，2例BMA见吞噬细胞。

表1 6例患儿一般资料

2.2 mNGS与BMA诊断阳性率

所有患儿均于入院2天内完善BMA，穿刺次数1～3 次。mNGS 组4 例（P2、P3、P4、P6）BMA 均未见利杜小体，全部通过mNGS检出利什曼原虫，中位序列数2 365.5（802.0～7 929.0），从发病至确诊延迟时间为34.0（16.0～39.0）天，mNGS诊断阳性率为100%。BMA组2例（P1、P5）通过BMA确诊后未行mNGS 检查，首次BMA 阳性仅1 例，发病至确诊时间间隔分别为62 天和90 天，BMA 诊断总阳性率为33.33%（2/6）。

2.3 治疗及并发症

所有患儿入院初期均给予阿昔洛韦（10 mg/kg）抗病毒，其中4 例给予特殊级抗生素，2 例予以限制级抗生素抗感染。6 例确诊前均给予免疫球蛋白1g/（kg·d），连用2d。5例在发病9.0（4.5～65.5）天开始给予地塞米松（10 mg/m2，1 次/d），确诊VL-HLH后停用激素，激素疗程12.0（8.5～26.0）天。3例给予依托泊苷（100mg/m2，2次/周）化疗，均在住院1周内开始，确诊VL-HLH后停用，化疗疗程中位数20.0天。因炎症因子风暴行血液透析滤过治疗3 例，合并呼吸衰竭行机械通气3 例。两组用药、器官支持及合并感染情况见表2。

表2 6例患儿治疗及并发症

mNGS 组有2 例因延迟确诊而接受药物化疗，骨髓抑制期出现严重细菌感染（P2 继发铜绿假单胞菌引起的脓毒性休克、呼吸衰竭；P3 继发侵袭性肺炎链球菌病），确诊VL-HLH 后停化疗方案及广谱抗生素，加用两性霉素B 脂质体（amphotericin B liposome，L-Amb）或锑剂治疗，最终痊愈。另外2例早期行mNGS 确诊VL-HLH，停用广谱抗生素及阿昔洛韦，分别给予葡萄糖酸锑钠及L-Amb，避免应用化疗药物，均无合并感染。BMA组中P1确诊前给予化疗32 天，骨髓抑制期合并重症肺炎，广谱抗生素治疗效果不理想，3次BMA后确诊VL-HLH后加用葡萄糖酸锑钠治疗，最终痊愈；P5 脾大为首发症状，后期合并发热，常规抗感染无效，在病程第90天行BMA确诊VL-HLH，给予葡萄糖酸锑钠治疗后缓解，见表2。

3 讨论

VL-HLH 是儿童中容易忽视的继发性HLH，利什曼原虫以前鞭毛体形态被单核淋巴细胞吞噬，成熟为无鞭毛体，并通过血液和淋巴管传播，影响网状内皮系统而引起VL[7]。利什曼原虫分布有明确的区域特点，全球90%以上利什曼病例发生在包括中国在内的10个国家[8]，国内发病率最高地区由西部的新疆维吾尔自治区、甘肃和四川省，逐渐向中部的山西、陕西省转移，而河北省近10 年未见相关病例报道[9-10]。本研究6 例患儿均长期定居在河北省，3 例有短暂疫区旅居史，为省外输入病例，其余3例否认疫区旅居史，为本地病例。分析原因：山西省阳泉市白蛉密度较高[11]，鹿泉与井陉相邻，位于河北省西部，与山西省阳泉市隔太行山脉相邻，这些地区具有海拔较低、气温较高、活动季节较长、土壤较湿润松散等较好的白蛉繁殖条件。

VL-HLH 确诊需满足HLH 的同时鉴定出利什曼原虫[12]，6 例患儿从出现临床症状到确诊的时间为38.0（27.3～69.0）天，其中3 例在首次住院时存在漏诊、误诊，P1 于第三次住院时方确诊。主要与以下因素有关：①临床表现无特异性，持续发热、脾肿大和全血细胞减少等，与严重感染、血液系统疾病及自身免疫性疾病等临床症状重叠[13-14]。②潜伏期长，利士曼原虫通过白蛉叮咬入侵人体血液循环，通过上调巨噬细胞和T 细胞的细胞因子信号转导抑制因子蛋白表达进行免疫逃逸[15-16]，因此潜伏期从数周到数年不等[17]，平均3～8个月[18]，有报道同一时间感染的双胞胎儿童，临床症状出现的间隔长达9 个月[19]，因此VL-HLH 的发病时间无季节性规律。本研究中有50.0%的儿童在冬季起病，发病季节不符合白蛉的活动特点，考虑与利什曼原虫感染后潜伏期长短不一有关。③病原学检查有局限性，BMA 是目前儿童利什曼原虫检测的常用手段。本研究所有对象均进行了BMA，其对VLHLH 的诊断阳性率为33.3%，BMA 要求骨髓内病原体负荷达到一定程度，且需要经验丰富的微生物学家才能保证显微镜下对利什曼原虫的检出率，因此，非流行地区敏感性低，结果存在偏倚[20]。免疫层析法是流行地区的常用筛查方法之一，高度特异性的PCR 有助于确诊VL-HLH，但上述两种检测方法均需要特定的试剂盒，限制了在非流行地区的开展应用[21]。

本组所有患儿入院初期即符合HLH 的诊断标准，早期入院的4例规范化疗效果差，且出现骨髓抑制及严重感染，且传统病原培养、血清学及常见病原PCR 均无阳性发现，对于没有预判病原的不明原因感染，予行mNGS，结果发现其对利什曼原虫检测阳性率明显高于BMA，与既往的报道一致[22]。不同于传统的病原检查方法，mNGS 直接对标本核酸进行高通量测序，可以同时检测多个病原体基因序列，与数据库包含的病原序列信息进行比对分析，实现全面无偏差筛查。然而，需要注意的是，核酸检测本身并不能证明已识别的微生物是致病原，研究结果必须在临床背景下进行解释[23]。

本研究6例儿童检出利什曼原虫后经L-Amb或锑剂治疗，病情迅速缓解，其中2例因早期行mNGS确诊VL-HLH，避免了化疗药物的使用。提示VLHLH的治疗关键在于抗利什曼原虫，而只有在抗利什曼原虫治疗反应不佳时，才应考虑进行免疫调节，与国外研究结果一致[24]。进行免疫调节治疗时需警惕骨髓抑制合并严重感染。相对于常规实验室检测，mNGS对于血液系统疾病合并感染的病原诊断价值更高[25]。由于早期广谱抗生素的使用和微生物培养的低阳性率，病例P2、P3常规病原学检查均为阴性，经mNGS 发现合并感染病原，为有效调整抗生素提供强有力依据。如能早期行mNGS检测并进行针对性抗利什曼原虫治疗，不仅可避免化疗后骨髓抑制期继发的严重感染，还能够快速、精准的获取检测样本中的合并病原信息。

本研究存在一定的局限性。第一，病例数较少，且BMA组病例未行mNGS，因此未能对相关数据进行统计学分析，相关结论尚需大样本量的数据进行验证。第二，mNGS对病原体的诊断尚无统一标准，本研究对患儿进行抗利什曼原虫治疗有效才验证了mNGS结果的准确性。

综上，儿童VL-HLH罕见，具有潜伏期长短不一、临床表现无特异性及常规辅助检查局限等特点，在非利什曼流行地区早期确诊困难，易延迟诊断，由此引发的免疫抑制治疗，不仅疗效差，且易出现骨髓抑制、严重感染等并发症。mNGS不仅可为早期识别儿童VL-HLH提供有效依据，还可快速、精准识别混合感染病原。建议对HLH-2004方案治疗不理想者，尽早行mNGS，以明确是否存在包括VL在内的罕见病原引起的继发性HLH。