干细胞治疗骨关节炎的研究进展

杨文华 李娟红

（首都医科大学附属北京世纪坛医院疼痛科，北京 100038）

骨关节炎(osteoarthritis, OA)是成年人关节炎中常见的类型，是导致关节疼痛、功能障碍的主要原因，也是导致残疾的第四大原因[1]。OA 最常见于膝关节，以进行性软骨退化、软骨下骨增生、骨赘形成、半月板退变、韧带钙化和滑膜增生等为特征[2]。美国约有3200 万人、全球超过2.4 亿人患有OA[3]。预计到2032 年，45 岁以上人群中约30%患有OA[4]。OA 的治疗方法包括早期的非手术治疗和后期的关节置换。非手术治疗包括控制体重、运动疗法、物理治疗、药物治疗等，以减轻疼痛、控制症状为主要目的，但治疗效果有限，不能阻止疾病的进展，最终会导致关节疼痛、功能障碍甚至残疾。目前，尚缺乏有效手段来干预OA 的发生和/或阻止OA 的进展。

干细胞具有沿着不同谱系分化的能力，能缓解疼痛，促进软骨恢复，改善关节功能。2001 年至2021年科学核心收藏网(Web of Science Core Collection)的出版物中显示干细胞被广泛用于OA 研究，其中软骨修复和旁分泌功能是目前干细胞机制的研究热点，而且干细胞治疗已经从基础研究逐步推进到临床应用阶段[1]。异基因骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cell, BM-MSCs)被证实为克罗恩病伴肛瘘的安全且有效的临床治疗手段[5]。

目前有关干细胞治疗OA 的研究大多侧重于软骨修复机制，而对镇痛机制的研究相对较少。本文将重点阐述干细胞治疗OA 的机制，尤其是镇痛机制的进展，同时对2020 年以来的动物实验和临床研究的最新进展进行评述。以期为干细胞治疗OA的基础与临床研究提供参考资料。

一、干细胞

干细胞包括成体干细胞和胚胎干细胞。胚胎干细胞是从胚泡的内细胞团中获得的，人类胚胎干细胞的使用涉及法律和伦理方面的顾虑，临床应用较少。而成体干细胞的使用涉及法律和伦理方面的问题较少，目前成体干细胞种类较多，间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)也叫间充质基质细胞，最早于1970 年被Friedenstein 等发现于人类骨髓中；脂肪来源的间充质干细胞(adipose-derived mesenchymal stem cells, ADMSCs)、骨髓干细胞、滑膜间充质干细胞和人脐带血液来源的间充质干细胞/Whatton's Jelly 源间充质干细胞是目前软骨组织中最广泛使用的MSCs 来源，每一种都具有其各自的软骨再生特征优势[6]。在过去的十年中，干细胞移植在修复神经病理性疼痛(neuropathic pain, NP)综合征的神经系统损伤方面显示出巨大的潜力，而不仅仅是提供暂时的缓解。干细胞治疗已成为NP的替代治疗方法。

1.干细胞治疗OA 的机制

（1）分化为软骨：MSCs 可以从软骨下骨迁移到受损部位，并分化为软骨细胞和成骨细胞来修复软骨和软骨下骨组织[7]。与软骨细胞共培养后，MSCs 显著提高软骨细胞标记基因aggrecan、sox-9和col-2 的mRNA 表达水平，促进软骨细胞增殖和抑制软骨细胞凋亡[8]。转化生长因子-β (transforming growth factor beta, TGF-β) 通过ERK/JNK 信号通路调节维生素D 的功能，继而促进MSCs 的细胞增殖和迁移，最终影响软骨细胞分化[9]。生长因子、支架和共培养技术等常用于改善MSCs 的软骨细胞分化潜能。神经生长因子可以显著上调MSCs 软骨特异性标记物的表达。纳米纤维基聚醚砜支架可以增强MSCs 分化为软骨的潜力，同时保持MSCs 的增殖和分化能力[10]。MSCs 分化为软骨细胞、促进软骨再生的效应仍存在争议。促进软骨再生在一些临床环境中观察到了，而在部分研究中没有[11]。这些差异可能是由于OA 程度较高的病人参与、活性软骨细胞数量稀少或随访时间短等因素导致。然而，也有研究认为MSCs 的作用可能不是由于其直接分化为再生或替代组织[11]。

（2）旁分泌：MSCs 参与组织修复的主要方式是旁分泌，通过分泌外泌体、释放多种具有不同特性的营养因子来减少组织损伤和促进组织修复。Platas等[12]报道ADMSCs 的条件培养基具有OA 保护作用，其机制可能是ADMSCs 旁分泌作用对抗炎症应激诱导的OA 软骨细胞过早衰老。TGF-β1 刺激可促进MSCs 外泌体中miR-135b 的表达上调；该外泌体与大鼠软骨细胞共培养，软骨细胞中SP1（抑制软骨细胞增殖）表达下调，细胞活力增强，软骨细胞增殖增加。MSCs 通过释放含miR-135b 的外泌体下调SP1 的表达，改善软骨细胞的活性[13]。与二维培养相比，3D 球体培养可以提高MSCs 分泌外泌体的产量，通过增强MSCs 的旁分泌效应来改善细胞恢复功能[14]。

（3）抗炎和免疫调节：降低趋化因子和炎症因子的浓度。脐带间充质干细胞 (umbilical cord mesenchymal stem cells, UC-MSCs) 治疗后兔血清MMP-3、MMP-13、白介素-6 (interleukin, IL-6)、IL-8 水平较治疗前明显下降；UC-MSCs 对OA 软骨和滑膜具有保护作用，这与抑制炎症反应相关[15]。

（4）“归巢”调节：MSCs 会优先聚集在组织损伤和炎症部位。在治疗OA 时，MSCs 能靶向传递到受损的关节软骨，抑制免疫介导的软骨破坏，并通过软骨分化和内在残余修复的旁分泌刺激促进软骨修复。1983 年，Gallation 首次提出循环中的淋巴细胞有迁移回派生它们的淋巴组织部位的倾向为“淋巴细胞的归巢”，后来“归巢”这一概念逐渐引申到干细胞。2009 年，Krap 等[16]将MSCs 的“归巢”定义为：MSCs 在目标组织的脉管系统中被捕获，跨越血管内皮细胞并迁移至目标组织的过程。归巢过程可分为5 个步骤：①系留和滚动(tethering and rolling)：MSCs 表达CD44，内皮细胞表达选择素，CD44 与选择素结合，使MSCs 沿着血管壁滚动。② 激活(activation)：G 蛋白偶联的趋化因子受体与内皮细胞中SDF-1 结合。③逮捕 (arrest)：MSCs 表达的VLA-4 与内皮细胞上的VCAM-1 相互作用。④渗出 (transmigration or diapedesis)：MSCs 在基质金属蛋白酶(MMPs)的作用下穿过内皮细胞层和基底膜。⑤迁移 (migration)：MSCs 在损伤部位释放的趋化信号的引导下，通过细胞外基质迁移[7]。在炎症损伤的情况下，损伤部位SDF-1 表达增加，与MSCs 表达的CXCR4 结合，使得MSCs 定植受损器官。TGFβ1 可以显著提高MSCs 表面CXCR4的表达和MSCs 的归巢率[17]。体外对MSCs 进行缺氧预处理也可以上调CXCR4 表达，从而显著增加MSCs 的归巢率并增强修复效果[18]。关节内给药后，人整合素α10β1 选择的MSCs 向兔膝关节软骨缺损的迁移和归巢[19]。有关MSC 与破骨细胞关系的研究较少，OA 破骨细胞生成增多，软骨下骨丢失增加。破骨细胞活性可诱导MSC 迁移和成骨，有利于MSCs 进入关节。MSCs 通过与破骨细胞接触、释放因子（如骨保护素）和细胞外囊泡等方式来影响破骨细胞分化、成熟[20]。OA 病人关节内注射ADMSCs 可改变循环破骨细胞前体的比例[11]。

2.干细胞对OA 镇痛的机制

疼痛是一种主观感受，动物的OA 疼痛感受只能通过行为学的观察、疼痛相关通路的检测来评估，因此动物OA 疼痛模型的参考作用有限。干细胞缓解OA 疼痛的研究相对较少，主要聚焦于抗炎作用。

（1）抑制炎症，调节免疫系统

MSCs 具有特定的免疫调节特性和抗炎功能，产生免疫调节和抗炎的物质，能够下调免疫炎症过程并促进组织再生[21]，缓解大鼠关节炎的炎症。可能有三种方式来适应免疫系统。①MSCs 通过抑制成熟树突状细胞的发育、抑制IL-2 诱导的NK 细胞增殖和降低NK 细胞的细胞毒性[22]来控制先天免疫。②MSCs 可以通过抑制细胞凋亡和减缓T 细胞和B 细胞的发育来调节获得性免疫[23]。③MSCs 可以将巨噬细胞/小胶质细胞从炎症 (M1) 表型转换为抗炎 (M2) 表型[24]。M1 表型可产生肿瘤坏死因子-α(tumour necrosis factor, TNF-α)、IL-β 等多种炎症因子，诱导一氧化氮合酶(iNOs)上调；M2 表型可分泌TGF-β、IL-10 等抗炎细胞因子[20]。BM-MSCs 鞘内注射，促使M1 型小胶质细胞转变为M2 型，并下调TNF-α、IL-1β 等炎症因子的表达，减轻神经炎症反应、缓解中枢敏化表达并促进巨噬细胞灭活因子 (IL-4、IL-10) 的释放[25]。BM-MSCs 抑制小胶质细胞和星形胶质细胞的活化，调节AMPK/NF-κB通路，减少脊髓中AMPK/NF-κB 依赖性神经炎症，从而缓解慢性束缚应激(chronic restraint stress,CRS) 引起的痛觉过敏[26]。MSCs 可产生胶质细胞源性神经营养因子(glial cell line-derived neurotrophic factor, GDNF)，抑制小胶质细胞M1 表型，促进M2 表型，抑制NF-κB，同时促进PI3K/AKT信号通路的激活，抑制神经炎症，从而缓解去神经痛[23]。BM-MSCs 通过分泌TSG-6 抑制同侧脊髓背角小胶质细胞中的TLR2/MyD88/NF-κB 通路的激活，抑制脊髓组织中坐骨神经慢性压迫损伤(chronic constriction injury, CCI) 模型诱导的神经炎症，改善机械性痛觉异常和热痛觉过敏[24]。从M1 到M2 的免疫转换有助于减少关节周围炎症、缓解OA。BM-MSCs 可以改善局部细胞功能、消除感染和抑制致病性免疫反应。④保护神经元：MSCs可产生GDNF，抑制神经炎症，缓解去神经痛，在神经系统疾病中发挥保护作用[23]。通过促进免疫细胞分泌或自身分泌营养因子（如TGF-β1、血管生长因子和神经营养因子等），促进受损神经纤维修复，改善炎症微环境[26]。Ichiseki 等[27]报道大鼠肩关节注射单碘乙酸盐 (monoiodoacetate, MIA) 的OA模型中，关节内注射MSCs 下调脊髓背角抗降钙素基因相关肽 (anti-calcitonin gene related peptide, CGRP)的表达，抑制疼痛中枢敏化，关节内给药MSCs 可以有效治疗早期关节炎的疼痛。

（2）MSCs 的“归巢”

MSCs 迁移到损伤部位发挥其对NP 的镇痛作用。脊神经结扎后脊髓中趋化因子配体13 (C-X-C motif chemokine ligand 13, CXCL13) 增加，CXCL13介导绿色荧光蛋白标记的IL-1β-BM-MSCs 定向迁移到同侧脊髓。IL-1β-BM-MSCs 可以通过降低脊髓中趋化因子C-C 基元配体7 (chemokine C-C motif ligand 7, CCL7) 的水平来抑制小胶质细胞的激活和神经性疼痛[28]。在树脂毒素介导的NP 小鼠模型中，BM-MSCs 移植可定向迁移至脊髓背角，通过减轻小胶质细胞活化和激活p38 MAPK 通路发挥镇痛作用[29]。MSCs 迁移机制的深入研究可能是提高OA镇痛疗效率的新靶点。

（3）阿片类受体

CXCL1-CXCR2 信号传导相关的中枢μ 阿片受体的激活在BM-MSC 缓解痛觉过敏中起着重要作用[30]。BM-MSCs 在不同的时间域中激活外周和中枢阿片受体缓解CCI 大鼠NP[31]。BM-MSCs 的单次静脉或局部损伤部位注射缓解CCI 疼痛超敏反应，在输注BM-MSCs 后1～5 周，纳洛酮（作用于外周和中枢阿片的受体拮抗剂）能再次诱发疼痛超敏反应，而纳洛酮甲氧碘（外周作用的阿片受体拮抗剂）仅在BM-MSCs 治疗的前3 周再次诱发痛觉过敏。RNA 干扰对脑干μ 阿片受体的局灶性下调逆转了BM-MSCs 移植的镇痛作用。

（4）分泌细胞外囊泡抑制疼痛

BM-MSCs 可间接通过释放囊泡发挥镇痛作用。胶原酶诱导的OA 小鼠模型中，关节内注射MSCs和MSCs 分泌组(secretome)产生了类似的结果，均可早期减轻OA 疼痛和保护关节软骨[32]。慢性压迫背根神经节(dorsal root ganglion, DRG)大鼠模型中，鞘内注射BM-MSCs 裂解物可以产生类似BM-MSCs的疼痛缓解作用，BM-MSCs 通过释放胞内物质（如外泌体、囊泡等）引起脊髓小胶质细胞P2X4R 表达下调来减轻神经性疼痛[25]。

二、干细胞治疗OA 的动物试验和临床研究

1.动物试验

动物实验表明，干细胞有利于缓解OA 疼痛、修复关节软骨和半月板损伤防止软骨降解、恢复软骨细胞增殖和抑制炎症反应（见表1）。同种异体BM-MSCs 外泌体促进MIA 诱导OA 大鼠的软骨修复和细胞外基质合成，上调软骨组织中COL2A1蛋白，下调MMP13 蛋白；减轻膝关节疼痛，抑制OA 大 鼠DRG 组 织 中CGRP 和iNOS 的 上 调[33]。MIA 诱导的大鼠OA 模型，宏观和组织学切片显示生理盐水(normal saline, NS)组关节软骨损伤、发炎、不均匀且薄，并有深染细胞浸润；基质血管成分 (stromal vascular fraction, SVF)和脂肪干细胞 (adipose-derived stem cells, ADSCs) 组的软骨表面在第14 天光滑明亮、已恢复到几乎正常；SVF 和ADSC组的白细胞计数高于NS 组。SVF 和ADSC 组在第7 天和第14 天的血浆IL-1β 水平降低。SVF 和ADSC有助于软骨损伤后的关节软骨再生[34]。脐带间充质干细胞 (umbilical cord mesenchymal stem cells, UC-MSCs)通过防止软骨降解、恢复软骨细胞增殖和抑制炎症反应来改善MIA 诱导的OA。UC-MSCs 下调基质金属蛋白酶-13 (matrix metalloproteinase-13, MMP13)、具有血小板反应蛋白基序的去整合素和金属蛋白酶5 (a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs 5, ADAMTS-5) 的表达，增强关节软骨中II 型胶原和ki67 的表达，降低IL-1β 和TNF-α 的表达，同时增加TNF-α 诱导的蛋白6 和IL-1 受体拮抗剂[35]。

表1 2020 年以来干细胞治疗OA 动物模型临床前试验总结

2.临床研究

临床研究表明，干细胞治疗OA 有利于缓解关节疼痛、修复关节软骨和半月板损伤、改善生活质量（见表2）。MSCs 用于膝骨关节炎疼痛管理尚未广泛应用于临床，仍处于基础研究阶段，未来可作为新向标予以深入研究[41]。

表2 2020 年以来干细胞治疗OA 临床研究总结

三、总结

干细胞具有分化和自我更新的能力，通过分化为软骨、旁分泌、抗炎和免疫调节、“归巢”等机制修复关节软骨，通过抑制炎症和调节免疫系统、归巢、调节阿片类受体、分泌细胞外囊泡等方式来缓解疼痛。更深入的研究干细胞的归巢调节和干细胞来源外泌体的分子机制，将有助于优化干细胞的OA 治疗效果。干细胞治疗 OA 有利于改善疼痛和功能评分，其对软骨信号和MRI 形态学改善的研究较少，生成软骨体积的测量需进一步研究。为了解决临床转化的有效性和安全性问题，干细胞的来源、剂量、注射次数和佐剂等的优化尚需相应的标准来规范和引领这一领域的研究。

利益冲突声明：作者声明本文无利益冲突。