DNA基因甲基化检测在大肠癌诊断中的研究进展*

张德文,张 丽 综述,朱喜丹 审校

1.自贡市第三人民医院检验科,四川自贡 643020;2.内江卫生与健康职业学院基础医学部,四川内江 641100;3.西南医科大学附属医院医学检验部,四川泸州646000

大肠癌(CRC)作为常见的恶性肿瘤,包括结肠癌和直肠癌。据国家癌症中心2022年发布的数据显示,肺癌、结肠癌、胃癌、肝癌和乳腺癌是排名前5的癌症,占新发病例总数的57.4%[1]。有研究表明,CRC患者在早期无明显临床症状,85%以上的患者一经发现就已经是晚期。CRC患者早期进行临床治疗,约90%的患者不需要化疗,5年生存率可达95%[2],由此提示开展有组织的早期筛查有助于降低CRC的病死率。现代肿瘤学研究认为,肿瘤的发生与抑癌基因的丢失和失活有关,发生表观遗传学的累积改变,该改变可以在癌症早期通过高灵敏度技术检测到[3]。DNA甲基化是目前最早被发现、研究最深入的表观遗传调控机制之一[4]。抑癌基因启动子区域胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤(CpG)岛的高甲基化,是诸多癌症发生早期的重要事件之一。因此,DNA甲基化相关标志物的检测有望成为CRC早期诊断的重要手段。本文就近年来DNA甲基化在CRC早期诊断中的应用展开综述,以期为后续研究CRC的早期诊断提供相关理论依据。

1 表观遗传学、甲基化及其在CRC中的作用

广义的表观遗传学是指在不改变DNA序列的情况下,通过DNA甲基化、组蛋白修饰和miRNA表达等方式发生可遗传的表型变化。表观遗传学控制的基因表达模式破坏会导致自身免疫性疾病、癌症和各种其他疾病。表观遗传的畸变在疾病早期就可以被检测出来[5],并且相比遗传变化的难以逆转,表观遗传所导致的变化可以在药物干预下发生一定逆转。随着靶向基因表达调控中所涉及的特定表观遗传机制药物的发展,表观遗传工具的开发和利用是一种可应用于各种疾病治疗的有效方法。因此,表观遗传学可作为新兴工具用于癌症的诊断和治疗。

DNA甲基化是生物体内普遍存在的表观遗传调节方式[6]。甲基化是DNA重要的修饰方式之一,是指在DNA甲基化转移酶的作用下,S-腺苷甲硫氨酸中的甲基基团共价结合到基因组DNA序列上CpG岛的二核苷酸胞嘧啶的5′C端,进而转变为5-甲基胞嘧啶的过程[7]。其中CpG岛是指基因组中一段含有大量C和G的重复序列区域。CRC抑癌基因中的CpG岛甲基化通常位于基因组C、G含量大于50%的启动子区域[8]。相对于结肠镜检测,CRC中基因甲基化的检测具有无创伤性、无侵入性、无饮食限制等优点,并且与早期诊断、预后、复发情况均密切相关[9]。

2 CRC早期诊断的常用DNA甲基化基因

2.1黏结蛋白聚糖2(SDC2)基因 SDC2基因属于Syndecans家族,该家族由进化保守的4个不同基因编码的Ⅰ型跨膜蛋白聚糖构成,其中SDC2由糖胺聚糖链共价连接的蛋白质核心组成[8]。有研究表明,SDC2主要在间充质细胞,如成纤维细胞和平滑肌细胞中表达,具有调节组织发育与稳态的功能,包括细胞增殖、分化、黏附、细胞骨架组织、迁移、伤口愈合、细胞基质通信、血管生成,还与炎症反应和癌症的发生有关[9-10]。众所周知,大多数癌症是由息肉引起的,息肉癌变过程需要10～15年,开始于异常的隐窝,演变为肿瘤前期病变(息肉),最终发展为结直肠癌[3]。2017年,OH等[11]通过单向线性靶标富集(LTE)和SDC2的定量甲基化特异性实时聚合酶链反应(qMSP)检测不同分期(Ⅰ～Ⅳ期)CRC患者(n=50)和癌前病变患者(n=21)及健康体检者(n=22)粪便中SDC2甲基化的DNA,其检测CRC的总体灵敏度为90.0%,检测小息肉的总体灵敏度为33.3%,特异度为90.9%。HAN等[12]通过对245例CRC患者粪便DNA中SDC2基因进行LTE和qMSP检测,CRC(0～Ⅳ期)的总体灵敏度为90.2%,特异度为90.2%;早期(0～Ⅱ期)的灵敏度为89.1%(114/128);晚期和非晚期腺瘤的检出率分别为66.7%(2/3)和24.4%(10/41),表明SDC2甲基化具备作为CRC早期检测的潜力。

梁霞等[13]通过比较56例原发性CRC患者与50例健康体检者的SDC2甲基化表达量、癌胚抗原(CEA)、糖类抗原19-9(CA19-9)水平发现,SDC2甲基化基因在CRC组织中呈高表达,并且SDC2甲基化基因诊断CRC的灵敏度和特异度均高于CEA、CA19-9及CEA联合CA-199的诊断结果。同时,MA等[14]以一种新的实时荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)检测试剂用于102例CRC患者中SDC2 CpG岛中含有2个差异甲基化区域的检测,结果显示,单独通过甲基化SDC2-A检测CRC的灵敏度为85.3%,特异度为96.2%;单独甲基化SDC2-B检测的灵敏度为83.3%,特异度为97.7%。然而,当甲基化SDC2-A和甲基化SDC2-B合并时,检测CRC的灵敏度提高至87.3%,特异度降低为94.6%。这预示着对SDC2 CpG岛中多个差异甲基化区域进行同时检测将更有助于CRC的早期诊断,并且检测结果相比肿瘤标志物更准确。事实上,CRC发生前期,肿瘤细胞脱落到结直肠腔的频率是正常大肠细胞的4～5倍,且早于血管侵袭[15],因此,从理论上讲,粪便SDC2基因检测比血液更适合作为早期发现大肠肿瘤的标本,NIU等[7]的研究结果也证明了这一结论。

2.2胞裂蛋白9(SEPT9)基因 SEPT9基因属于细胞骨架三磷酸鸟苷结合蛋白家族[16]。目前,在哺乳动物中已鉴定出13个SEPT基因(SEPT1～SEPT12和SEPT14),可以分为4个亚组(SEPT2、SEPT3、SEPT6和SEPT7)。其中SEPT9是一种细胞周期相关蛋白,在细胞分裂过程中协调肌球蛋白和运动蛋白[17]。当SEPT9基因在体内异常表达或出现缺失时,细胞分裂会受到严重影响,在一定程度上导致恶性肿瘤发生。AMIR等[18]提出,SEPT9过表达可抑制缺氧诱导因子-1(HIF-1)的泛素化和降解,提高HIF-1的转录活性和下游基因,如血管内皮生长因子的表达。血管内皮生长因子过表达会促进肿瘤组织的血管生成,这为肿瘤的增殖和浸润奠定了基础。在CRC中,当SEPT9基因启动子区域CpG岛出现高度甲基化时,会阻断SEPT9基因的表达,导致其抗癌功能丧失。2008年以来,已有许多研究团队发表了一系列通过检测SEPT9基因甲基化来监测CRC的临床数据。TTH等[19]使用EpiproColon2.0 RT-PCR定性检测93例结直肠癌患者和94例健康体检者的血标本,相对于粪便隐血试验、癌胚抗原(CEA)和EpiproColon1.0 RT-PCR的检测,EpiproColon2.0 RT-PCR检测CRC的灵敏度为79.3%,特异度为98.9%,其中对Ⅰ期CRC的灵敏度为95.6%,特异度为84.8%,对Ⅱ～Ⅳ期CRC的灵敏度可达100.0%,特异度为98.9%。这表明SEPT9基因比粪便隐血试验和CEA更敏感和特异,也更适合于CRC Ⅱ～Ⅳ期患者的评估。

2.3分泌型卷曲相关蛋白1(SFRP1)基因 SFRP1基因属于SFRPs家族,是新近发现的对Wnt信号通路有抑制作用的候选抑癌基因[20]。SFRP1基因启动子区域的高度甲基化是基因失活的重要原因,Wnt信号通路的异常激活会使CRC中细胞凋亡受到抑制,肿瘤细胞出现大量增殖[21]。SFRP1基因不仅在早期CRC中会出现高度甲基化,而且在大肠息肉患者中也会出现。银广悦等[22]选取32例健康体检者(对照组)与50例CRC患者(CRC组)、30例大肠增生性息肉患者(增生组)、36例大肠腺瘤患者(腺瘤组)作为研究对象,分析粪便中Wnt抑制因子-1(WIF-1)及SFRP1基因甲基化情况后发现,CRC组WIF-1及SFRP1基因甲基化率为60.0%及64.0%,增生组为20.0%及20.0%,腺瘤组为44.4%及52.8%。联合WIF-1及SFRP1检测对大肠腺瘤及CRC的灵敏度分别为66.7%及76.0%,且2个基因在腺瘤组及CRC组中的甲基化水平均高于对照组及增生组。

3 DNA甲基化基因与其他技术联合诊断CRC

目前,CRC的诊断方法较多,包括粪便隐血试验、结直肠镜检查、血清肿瘤标志物筛查、粪便DNA检查、病理组织活检等。DNA甲基化作为近年来越来越受认可的CRC诊断方法,虽然其具备无创性、无侵入性、较高的灵敏度和特异度,但是标本质量容易受到患者饮食、药物等因素的影响,且标本处理,尤其是粪便标本的处理较为复杂,限制其用于大范围人群的筛查。因此,采用DNA甲基化检测与其他检测方法联合诊断CRC,可提高检测的诊断价值。

潘辉等[23]经过对64例CRC患者粪便标本进行甲基化特异性 PCR检测后,粪便基因SDC2和BMP3联合检测结直肠癌的诊断效能优于BMP3检测。谭琪等[24]采用荧光PCR同步检测外周血血浆游离SEPT9、SDC2、支链氨基酸氨基转移酶1(BCAT1)3种基因中甲基化状态发现,血浆SEPT9、SDC2、BCAT1甲基化联合检测在CRC组中Ⅰ～Ⅳ期的阳性率分别为72.7%(16/22)、87.2%(34/39)、85.7%(30/35)和96.0%(24/25),其在结直肠癌Ⅰ～Ⅲ期阳性率明显高于CEA,差异均有统计学意义(P<0.05),在此研究中可以发现,联合分子标记物检测可在一定程度上提高灵敏度,但临床早期CRC的诊断还需要结合其他检测方法和临床症状进行综合判断。

李建等[25]通过收集47例CRC患者和33例非结直肠癌体检者的外周血对其进行SFRP1、SEPT9基因甲基化和粪便隐血试验结合检测,结果显示,SFRP1和SEPT9基因甲基化诊断结直肠癌的灵敏度为80.0%,特异度为95.3%,粪便隐血试验的灵敏度为86.3%,特异度为54.3%,二者联合检测的灵敏度为97.6%,特异度为96.8%,明显高于单项检测。李建等[25]研究表明,DNA甲基化与粪便隐血试验联合检测具有无创、采样简单、依从性好、实验方法稳定等特点,更适合于临床。吴秀方等[26]评估对照组、腺瘤组、早期癌组、进展期癌组患者血浆中SEPT9基因甲基化、血清CEA单项及二者联合检测后发现,早期癌组患者血浆SEPT9甲基化和血清CEA检测的阳性率分别为33.3%和16.7%,二者联合检测的阳性率可提高至41.7%;进展期癌组患者血浆SEPT9甲基化和血清CEA检测的阳性率分别为88.9%和55.6%,二者联合检测的阳性率可达到100.0%,表明血浆SEPT9甲基化单项检测用于鉴别腺瘤和早期癌症价值有限,在早期和进展期CRC患者中,血浆SEPT9甲基化检测阳性率均高于血清CEA,二者联合检测的诊断价值更高。高海锋等[27]在血浆SEPT9甲基化、血清CEA的基础上,联合糖类抗原(CA)724诊断CRC发现,血清CEA检测诊断CRC的灵敏度不及血浆SEPT9基因甲基化,但特异度和阴性预测值均最高,可以弥补SEPT9基因甲基化和CA724诊断过程中误诊率高的不足;CA724检测虽然灵敏度较低,但特异度较SEPT9基因甲基化高,亦可弥补SEPT9基因甲基化误诊率高的不足。SEPT9甲基化、血清CEA、CA724联合检测,很好地实现了优势互补,快速、准确、灵敏度高、患者依从性好及适于普查等优点,极大地提高了CRC的诊断效率。

梁霞等[13]经过比较SDC2和SEPT9基因甲基化检测的阳性率及二者联合结肠镜检查对进展性CRC的检出率,在1 000例筛查对象中,粪便SDC2基因甲基化检测阳性率明显高于血浆SEPT9基因甲基化,粪便SDC2基因甲基化检测联合结肠镜检查的检出率均明显高于血浆SEPT9基因甲基化检测联合结肠镜检查的筛查率,表明粪便SDC2甲基化检测联合结肠镜检查可作为CRC早期筛查的策略之一。龚志贇等[28]选取结直肠癌患者51例、结直肠腺瘤患者22例、健康体检者39例的粪便和血清标本,分析结果后发现,血清CEA联合粪便SDC2基因甲基化检测可将SDC2基因甲基化单项检测CRC阳性率从84.3%提高至90.2%,有效提升了CRC的检出率。

4 小 结

CRC是目前中国男性发病率排名第3的癌症[1],以早期无明显的临床病理症状,一经发现就已经是中晚期为主要特点,对其进行有效早期诊断、预后、复发的检测十分必要。目前,虽然检测方法较多,但各有优缺点。粪便隐血试验诊断CRC的特异度较低,且检测结果易受到食物、药物等因素的影响而不稳定;结直肠镜是侵入性检查,患者依从性较差,且易引起肠穿孔、感染等并发症,不易被患者接受;血清肿瘤标志物检测虽然是常规筛查手段,但其灵敏度和特异度较低,对于早期病变诊断价值不大;DNA甲基化无创伤、无侵入,灵敏度和特异度较高,但标本质量容易受到患者饮食、药物等因素的影响。SDC2甲基化在早期结直肠癌患者的血液和粪便标本中检出率高,并且粪便标本SDC2甲基化具备更易检出,可作为CRC早期检测指标。但SDC2甲基化单位点检测的特异度、灵敏度不如多位点,即联合检测诊断能更快、更准确地监测CRC的发生和发展。本研究认为,采用DNA甲基化多位点与其他方法联合检测对CRC进行诊断,可提高早期诊断价值。