丙泊酚对发育大脑毒性作用机制的研究进展

夏慕超 梁 超 缪长虹

丙泊酚是临床常用的静脉麻醉药,多用于儿童麻醉的诱导和维持,其对中枢神经系统的作用涉及多种神经递质间的相互作用机制,主要为γ-氨基丁酸(GABA)的相关分子机制。尽管,美国FDA早在1989年即批准丙泊酚在临床使用,但其说明的适用范围中仍不包含3岁以下儿童的麻醉诱导。目前,针对全身麻醉药物的动物模型的实验结果皆显示,该类麻醉药物可引发中枢神经系统的不良事件,包括广泛的神经元凋亡、长期的学习记忆障碍和行为异常等。丙泊酚是否并如何引起发育中大脑的神经毒性作用尚不明确,这亦是当前麻醉学领域研究的焦点。明确丙泊酚对发育大脑的影响,对今后儿童合理麻醉用药的研究和方案的制订具有重要意义。本文总结将现阶段已发现的丙泊酚致发育神经毒性的相关分子机制,并形成综述。

1 突触生长期GABA受体可影响神经元发育成熟

突触是神经元连接的关键,哺乳动物的大脑在出生后最重要的一个阶段是经历脑突触生长期(即突触发生)。在相当短的时间内(出生后20～21 d),发育中的人类大脑的重量即可达到成人脑重量的90%～95%。突触生长期包含了许多关键的发育环节,如神经元迁移、突触形成、血脑屏障建立和适应性免疫系统的成熟等[1]。哺乳动物的神经元在出生后首先大量增殖树突的分支并互相接触,以增加突触密度;随后,在神经活动下选择性地修剪多余突触;在正常的突触形成过程中,无法形成突触接触的神经元将经历程序性细胞死亡;这种在突触形成和细化期间发生的突触选择性消除称为突触修饰[2]。大脑发育中的这种突触特性被认为是突触可塑性的生物基础及皮层放电环路形成的基本过程。依赖于神经活动的突触可塑性对于皮层回路的细致发育分化至关重要,而麻醉和睡眠会抑制突触前和突触后的尖峰活动,从而影响突触稳定性[3]。

在神经元的发育成熟、迁移分化和突触形成过程中,兴奋性和抑制性神经递质参与了上述所有的调控。在成熟的大脑中,最重要的抑制性神经递质是GABA,而在早期发育阶段,由于细胞内的氯离子(Cl-)浓度较高,GABA受体是兴奋性的,不成熟的钠离子/钾离子/2氯离子(Na+/K+/2Cl-)转运蛋白1(Na-K-Cl cotransporter 1, NKCC1)产生Cl-内流,导致未成熟神经元的去极化。在发育过程中,GABA不会一直保持兴奋性,一旦成熟的Cl-转运蛋白K+-Cl-转运体亚型2(potassium-chloride cotransporter 2, KCC2)表达,此时GABA受体就会将Cl-主动转运出神经细胞,成熟大脑细胞内的Cl-浓度降低,GABA受体从兴奋性作用转变为抑制性作用[4]。GABA受体的这种电生理性质的转换与神经元的成熟偶联。人类幼儿的这种转换从足月出生后约15周开始,至1周岁左右完成。生长因子是另一种与神经发育有关的重要因素,例如神经生长因子(NGF)和脑源性神经营养因子(BDNF)[5]。这些因素皆调节细胞的分化、轴突和树突的生成,以及神经元细胞的存活。

2 丙泊酚致发育神经毒性的相关分子机制

2.1 神经干细胞(neural stem cell,NSC)增殖障碍 NSC在神经发生过程中至关重要,其源于胚胎时期的神经组织,具有很强的自我更新及分化潜能,可分化为中枢神经系统的各类细胞。研究[6]结果表明,丙泊酚通过对NSC的作用影响神经发生。核糖核酸(RNA)测序分析结果显示,丙泊酚干预可导致一系列钙依赖性基因表达的下调,同时丙泊酚可显著降低钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)、AMP依赖的蛋白激酶(AMPK)和转录激活因子5(ATF5)的水平,表明CaMKⅡ/AMPK/ATF5信号通路可能参与了丙泊酚对NSC的抑制作用。有学者在大鼠妊娠第14天提取其胎儿中的NSC,加入麻醉剂量的丙泊酚共培养24 h后,组蛋白相关DNA片段的ELISA结果显示,丙泊酚可引起NSC的DNA氧化损伤,使细胞停止增殖并抑制其线粒体活性,足量的抗氧化剂可在一定程度上缓解这种氧化应激反应[7]。该研究结果提示,丙泊酚的毒性作用可直接作用于胚胎发育阶段,氧化应激反应可能是丙泊酚毒性作用的潜在机制。在超临床麻醉剂量的条件下,丙泊酚剂量依赖性地增加了神经前体细胞(neural precursor cell,NPC)乳酸脱氢酶的释放,丙泊酚诱导的乳酸脱氢酶释放不会被GABA A型受体阻断剂或钙内流抑制,也不受半胱氨酸蛋白酶(caspase)3或7的影响。但使用化合物配体对GABA A型受体的直接激活不会增加NPC的乳酸脱氢酶释放,同时以上现象亦未在低浓度的丙泊酚作用下被观察到[8]。在人类NSC衍生模型中,长期接触丙泊酚会导致TUNEL阳性细胞数量显著增加,以及β-微管蛋白阳性神经元数量显著减少,表明丙泊酚可诱导NSC的凋亡[9]。临床麻醉剂量的丙泊酚可能对发育大脑中处于不同分化阶段的细胞产生多种影响。由此可见,未来的研究需关注丙泊酚对不同的脑细胞类型和不同的大脑区域的麻醉效应。

2.2 树突发育障碍 树突是形成突触连接的重要结构。信息依赖性的大脑活动可促进神经环路的形成,而外界信息减少或神经元损伤可干扰神经环路的稳定,这种可塑性存在于树突棘(即形成突触的主要部位)中。丙泊酚可通过破坏细胞完整性或突触连接性进而影响大脑正常的功能性连接[10]。有学者通过高尔基染色观察到产前暴露于丙泊酚的大鼠脑中海马的阿蒙角1区(cornu Ammonis 1,CA1)和阿蒙角3区(cornu Ammonis 3,CA3)处的锥体神经元的树突分支较少,且长度明显短于对照组[11]。这一结果与2011年Briner等[12]的研究结果一致,该研究发现麻醉剂在大脑发育过程中可显著影响树突棘(即突触)的形成。Briner等对Wistar大鼠在出生后早期的特定发育阶段予以丙泊酚麻醉,将丙泊酚注射到内侧前额叶皮层的第5层锥体神经元后,应用共聚焦显微镜观察并评估丙泊酚对神经元突触发育的短期和长期影响。出生后第5、10天接触丙泊酚的幼鼠树突棘密度显著降低,而在其出生后第15、20或30天给药时,丙泊酚的干预却可显著增高幼鼠树突棘密度,并伴随着突触数量的增多。重要的是,丙泊酚诱导的树突棘密度的改变会一直持续至幼鼠出生后的第90天。该研究结果表明,丙泊酚麻醉可迅速引起幼鼠树突棘密度的变化,这种作用与幼鼠的发育阶段密切相关,持续至其成年期,并伴有突触数量的改变;提示产后早期的麻醉干预可能会永久性地损害发育大脑神经回路的形成。Wan等[13]应用电生理测量长时程增强(LTP)评估出生后60 d大鼠的海马突触功能,并加入莫里斯水迷宫(MWM)实验、新物体识别测试(NORT)和物体定位测试(OLT)评估大鼠的学习和记忆能力;结果表明,丙泊酚麻醉后,除大鼠海马神经元的树突分支数显著减少、总树突长度显著延长和树突棘密度显著降低外,反复接触丙泊酚可显著延长大鼠逃逸潜伏期,缩短其在目标象限内停留的时间并减少跨平台次数。这些数据提示新生儿期反复接触丙泊酚可显著缩短大鼠对新环境物体或位置的调查时间,反映了丙泊酚会损害大鼠海马的突触可塑性和成年后的识别功能。

2.3 神经炎症 关于丙泊酚暴露后神经炎症的相关研究的结果存在一定差异。有研究[14]对出生后第10天或第20天时的大鼠进行6 h的丙泊酚麻醉,出生第10天组的大鼠前额叶皮层中TNF的mRNA表达水平短暂地增高了1.8倍左右,并且该组中两种趋化因子(CCL2和CCL3)的mRNA表达水平也短暂增高;而大鼠海马中的TNF水平无显著变化。出生第20天组的大鼠TNF的mRNA表达水平无变化;同时,两组大鼠IL-6和IL-1β的mRNA表达水平均未产生显著的变化。采用丙泊酚麻醉不足以对大脑突触生长期的中枢神经系统的炎症因子表达产生显著影响。因此,上述研究和部分研究结果并不支持神经炎症通路参与丙泊酚相关神经毒性作用的观点。Han等[15]研究结果表明,重复使用低剂量丙泊酚5 d未对小鼠认知功能和神经细胞凋亡产生显著影响,而重复使用中、高剂量丙泊酚可显著增高凋亡因子(caspase-3和Bax)及炎症因子(IL-1β、IL-6 和 TNF-α)的表达水平,并损害小鼠的认知功能。此外,也有学者发现丙泊酚可以剂量依赖性地降低小鼠海马HT-22细胞的增殖能力并增加细胞凋亡。丙泊酚处理的HT-22细胞中钙通道电压依赖型L型α1S亚基(Cav-1)表达增加,Cav-1促进小GTP酶(rat sarcoma, Ras)/成纤维细胞生长因子受体激酶(fibroblast growth factor receptor kinase, Raf)/细胞外信号调控蛋白激酶(extracellular signal-regulated kinase, ERK),即Ras/Raf/ERK通路的激活,这是参与细胞增殖和凋亡的重要通路[16]。当前,丙泊酚神经毒性与神经炎症之间的相关性尚未得到完全证实,且相当一部分研究认为丙泊酚对神经系统存在一定的抗炎作用。因此,这方面的结论及其机制需进一步的研究证实。

2.4 线粒体裂变 线粒体维持着细胞的许多重要功能,包括能量生成、细胞信号转导和细胞凋亡等。不平衡的线粒体融合和裂变会导致包括神经变性在内的各种病理状态。近年来,学者开始关注线粒体动力学在丙泊酚诱导的神经毒性中的作用。动力蛋白相关蛋白1(dynamin-related protein 1,Drp1)是线粒体裂变的关键调节因子。有学者评估了人类胚胎干细胞(human embryonic stem cell, hESC)衍生神经元暴露于丙泊酚后的线粒体动力学的变化,以及这些变化在丙泊酚诱导的神经毒性中的作用。hESC衍生的神经元暴露于20 μg/mL丙泊酚6 h会导致其细胞死亡、线粒体裂变增加和线粒体通透性转换孔(mPTP)提前开放,以及线粒体膜电位降低。此外,丙泊酚还改变了细胞周期蛋白依赖性激酶1(cyclin dependent kinase 1,CDK1)和Drp1的表达,但未显著改变线粒体融合相关蛋白的表达。上述结果提示,丙泊酚可通过CDK1/Drp1诱导线粒体裂变和mPTP开放影响下神经元细胞的死亡[17]。Liang等[18]研究发现,丙泊酚可诱导NSC线粒体变形、空泡化和肿胀,并通过PTEN诱导的激酶1(PTEN induced putative kinase 1,PINK1)介导的线粒体途径调节NSC的增殖、分化和凋亡。而高剂量的丙泊酚(100～200 μmol/L)会明显增强神经元的线粒体裂变,降低细胞存活率[19];这提示丙泊酚对线粒体的影响具有一定的剂量依赖性。Iqbal等[20]使用P110肽[一种无毒的、7个氨基酸长的Drp1/线粒体分裂蛋白1(mitochondrial fission protein 1, Fis1)的选择性抑制剂]不仅可减轻麻醉剂诱导的神经毒性,还可减轻皮层细胞因地呋喃、丙泊酚和氯胺酮诱导的线粒体断裂产生的损伤,这也是第1项关于Fis1受体介导的裂变与麻醉药物引起的畸变相关联的研究。这与Zhao等[21]的研究结果一致,其应用免疫荧光检测方法发现,在脊髓损伤期间丙泊酚可以显著抑制Drp1从细胞质转移至线粒体。因此,丙泊酚可通过降低Drp1和Fis1的水平抑制Drp1与线粒体的共定位。这也从侧面提示,丙泊酚可通过线粒体能量代谢途径诱导神经损伤。

2.5 微核糖核酸(microRNA) microRNA是一种内源性非编码RNA,通过负向调控靶基因的表达参与生命过程中的一系列重要进程,包括早期发育、细胞增殖和细胞凋亡等。目前,已鉴定出数百种在大脑富集的microRNA,部分microRNA与神经退行性疾病密切相关。研究[22]结果表明,丙泊酚麻醉处理小鼠后,其脑组织中microRNA34a表达增高,microRNA34a抑制剂改善了实验动物因丙泊酚麻醉所致的神经损伤诱发的学习和记忆功能减退,并抑制了海马的细胞凋亡。经丙泊酚处理的大鼠海马神经元中microRNA215的表达水平显著减低。应用microRNA215类似物可增强丙泊酚处理的新生大鼠海马神经元的细胞活性并抑制细胞凋亡[23]。Jiang等[24]则发现丙泊酚抑制NSC的增殖、神经元分化和迁移,同时上调microRNA141-3p表达;沉默microRNA141-3p可消除丙泊酚抑制NSC神经增殖、神经元分化和迁移的影响;而microRNA141-3p的直接靶向调控胰岛素样生长因子2 mRNA结合蛋白2(insulin-like growth factor 2 mRNA-binding protein 2, IGF2BP2)的过表达,削弱了丙泊酚和microRNA141-3p对NSC神经发生的影响;提示丙泊酚通过microRNA141-3p/IGF2BP2轴抑制NSC的神经发生。上述研究结果表明,microRNA相关机制参与了丙泊酚诱导的神经毒性,从而引起模型动物认知功能下降和记忆障碍。然而,这些实验结果在细胞水平仍存在诸多差异。故microRNA可作为认知障碍或神经系统毒性的潜在生物标志物。未来基因组学和蛋白质组学的整合有助于研究者进一步了解microRNA对特定基因靶标的调控机制。

2.6 神经营养因子表达失调 神经营养蛋白是一类在大脑发育中发挥重要作用的分泌蛋白家族,通常在神经末梢以受体介导入细胞的方式进入神经末梢,再经逆向轴浆运输抵达细胞体,促进细胞体合成有关的蛋白质从而支持神经元的生长发育,调节突触的可塑性等。BDNF在突触小泡内以前体脑源性神经营养因子(pro-BDNF)的形式储存,并在突触间隙中被蛋白质水解为成熟的BDNF。BDNF在大脑中高水平表达,其转录、加工和分泌都受突触活动的调节。pro-BDNF可与p75神经营养因子受体(p75NTR)结合并激活RhoA,后者在细胞凋亡前调节肌动蛋白细胞骨架的聚合作用[25]。在脑损伤时,p75NTR表达水平增高,这与促凋亡信号转导有关。丙泊酚对p75NTR的超诱导作用和伴随的神经营养因子加工抑制可进一步加剧p75NTR介导的神经元凋亡[26]。研究[27]显示,丙泊酚麻醉后的大鼠会表现出长期的空间学习和记忆障碍,海马中蛋白激酶A(protein kinase A, PKA)、环磷酸腺苷应答元件结合蛋白质(cAMP response element-binding protein, CREB)和BDNF的蛋白质表达长期下调。这种早期的丙泊酚暴露可导致成年后的长期学习和记忆障碍,其机制与PKA-CREB-BDNF信号通路的抑制相关。

3 总结与展望

综上所述,丙泊酚诱导的神经毒性作用涉及一系列复杂的分子效应机制。但在大脑发育关键期,丙泊酚所致毒性作用的主要机制及其与各种分子机制之间的因果关系尚不明确。迄今为止,尚无令人信服的实验证据表明丙泊酚在幼年期大脑引起的毒性效应会导致长期的认知行为障碍,因此丙泊酚应用于儿童是否安全可靠,仍有待进一步研究。目前来说,寻找合适的模型将动物行为学研究结果与临床应用相联系,也是未来探索丙泊酚毒性作用与剂量效应关系的重要方向。故在找到更多确切的证据前,不建议轻易更改儿童麻醉用药的临床管理方案。