基于表面增强拉曼光谱技术快速检测西瓜中的噁霉灵

刘任 辛美果

摘 要：本文建立了基于表面增强拉曼光谱技术快速检测西瓜中的噁霉灵农药残留的方法。结果表明，密度泛函计算与固体标准品对比得出噁霉灵在600 cm-1、924 cm-1、1 258 cm-1、1 489 cm-1、1 623 cm-1、2 937 cm-1和3 155 cm-1处有明显的特征峰。当硝酸银与盐酸羟胺按照5∶1体积比配制银溶胶时，且在保持10 ?L噁霉灵农药体积不变的情况下，加入7.5 ?L的银溶胶，噁霉灵的拉曼特征峰强度最大，表面增强效果最好。在实际食品基质西瓜中，噁霉灵的最低检出浓度为10-4 mol·L-1。该方法检测限低，灵敏度高，无需复杂的前处理，可实现西瓜中噁霉灵的快速检测。

关键词：密度泛函理论；表面增强拉曼光谱；噁霉灵

Rapid Detection of Hymexazol in Watermelon Based on Surface-Enhanced Raman Spectroscopy

LIU Ren， XIN Meiguo*

（Foshan University， Foshan 528000， China）

Abstract： In this paper， a method for rapid detection of hymexazol pesticide residues in watermelon was developed based on surface-enhanced Raman spectroscopy. The results showed that the density functional calculation compared with the solid standard product showed that hymexazol had obvious characteristic peaks at 600 cm-1，

924 cm-1， 1 258 cm-1， 1 489 cm-1， 1 623 cm-1， 2 937 cm-1 and 3 155 cm-1. When silver nitrate and hydroxylamine hydrochloride were prepared according to the volume ratio of 5∶1， the Raman characteristic peak strength of hymexazol  was the highest and the surface enhancement effect was the best when the volume of hymexazol  pesticide was kept unchanged at 10 ?L and 7.5 ?L silver sol was added. In the actual food substrate watermelon， the lowest detectable concentration of hymexazol  was 10-4 mol·L-1. This method has low detection limit， high sensitivity and no need for complex pretreatment， and can achieve rapid detection of hymexazol  in watermelon.

Keywords： density functional theory; surface-enhanced raman spectroscopy; hymexazol

農药是用来控制害虫、抑制真菌、消灭杂草的具备多种物理或化学特性的有机化合物[1]。我国是一个农业大国[2]，杀菌剂类农药在农业中的应用极其广泛[3]。但是，过多地使用杀菌剂类农药，很容易在农作物中形成农药残留，食用含农药残留的农作物可能会引发人体的慢、急性中毒。因此，有必要对食品中的农药残留进行检测。噁霉灵的化学名称是3-羟基-5-甲基异噁唑，CAS号是10004-44-1[4]，属噁唑类杀菌剂[5]，是日本三共株式会社研发的一种效果极佳的内吸性广谱杀菌剂[6-7]。噁霉灵可被用于真菌引起的各种疾病的治疗。目前文献中关于噁霉灵残留检测的常规方法主要是液相、气相、液相色谱-质谱联用，常规方法具有预处理时间长、需要专业检测人员检测、不能满足食品监管部门的现场快速检测的缺点[4]。因此，有必要研究噁霉灵的快速现场检测方法。

密度泛函理论（Density Functional Theory，DFT）不仅能够直观地描述分子振动情况，而且能够极大地减少计算量，被广泛应用于分子的结构与性质、反应机理、振动光谱等方面的研究[8]。借助密度泛函理论，可以预测噁霉灵的理论拉曼光谱。表面增强拉曼光谱技术（Surface-Enhanced Raman Spectroscopy，SERS）是基于表面增强拉曼散射现象发展而来的技术。SERS技术反映的是单个分子的振动信息。因此，即使是极低浓度的样品，也能通过具有超高灵敏度的SERS技术检测出来[9]。而SERS技术作为一种高效的光谱检测方法，已经在农产品检测、食品安全检测、医药及生物安全等多个领域实现了广泛应用。

本文基于表面增强拉曼光谱技术，借助密度泛函理论预测噁霉灵的理论拉曼光谱，首次获得了噁霉灵的表面增强拉曼光谱，同时优化了表面增强拉曼光谱的检测条件，实现了在实际食品基质西瓜中，通过将噁霉灵加标到西瓜基质中检测噁霉灵的表面增强拉曼光谱，该方法的最低检出浓度低，为食品监管部门快速现场检测噁霉灵提供了有效依据。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与设备

西瓜，学校超市。

乙腈（分析纯）、硝酸银标准溶液（分析纯）、盐酸羟胺（分析纯）、噁霉灵（纯度99.8%），广州春畅生物技术开发有限公司；实验用水为超纯水。

LabRAM HR Evolution显微共焦拉曼光谱仪，HORIBA Scientific公司；BSA2202s电子天平，赛多利斯科学仪器有限公司；MINI-10K迷你离心机，广州双螺旋基因技术有限公司。

1.2 實验方法

1.2.1 密度泛函理论计算

在Gaussian View 6.0软件中绘制噁霉灵农药分子的几何结构图，在Gaussian 16W中基于密度泛函理论，设置参数为b3lyp/6-31g（d，p），计算获得噁霉灵分子的几何优化结构图和理论拉曼光谱图。

1.2.2 噁霉灵固体标准品的拉曼光谱的检测

取噁霉灵固体标准品适量于干净的载玻片上，平铺置于显微共焦拉曼光谱仪的载物台上，进行检测得到拉曼光谱图。

1.2.3 表面增强拉曼检测条件的优化

准确称量噁霉灵标准品0.019 8 g溶解于1 mL乙腈中，得到10-1 mol·L-1的标准品溶液，然后依次稀释得到10-2 mol·L-1、10-3 mol·L-1、10-4 mol·L-1、10-5 mol·L-1和10-6 mol·L-1系列浓度梯度的标准品溶液。

（1）探究噁霉灵的特征峰峰强与按照不同体积比配制银溶胶的关系。利用盐酸羟胺还原法制备纳米银增强基底[10]，将硝酸银与盐酸羟胺分别按照1∶1、3∶1、5∶1、7∶1和9∶1比例配制1 000 ?L体系的银溶胶增强基底，取配制好的7.5 ?L银溶胶与10 ?L 10-2 mol·L-1的噁霉灵溶液，混合均匀，取

10 ?L上述混合均匀的银溶胶与噁霉灵溶液滴加在干净的载玻片上检测拉曼光谱。

（2）探究噁霉灵的特征峰峰强与银溶胶加入量的关系。选择上述对噁霉灵增强效果最好的体积比银溶胶，分别将2.5 ?L、5.0 ?L、7.5 ?L、10.0 ?L和

12.5 ?L的银溶胶加入10 ?L 10-2 mol·L-1的噁霉灵标准溶液中，混合均匀，取10 ?L上述混合均匀的银溶胶与噁霉灵溶液滴加在干净的载玻片上检测拉曼光谱。

1.2.4 表面增强拉曼光谱的检测

将学校超市的西瓜切块、榨汁、过滤和离心后取上清液，将配制好的系列浓度梯度噁霉灵标准溶液各取10 ?L分别加标到10 ?L的上清液中作为待检测溶液，将硝酸银和盐酸羟胺按照优化后的体积比配制成银溶胶，取优化后的银溶胶的加入量加入待检测溶液中混合均匀，立即对噁霉灵进行表面增强拉曼光谱检测。

2 结果与分析

2.1 噁霉灵分子的几何优化结构和特征峰峰位归属

2.1.1 经过DFT优化后的噁霉灵分子结构图

根据密度泛函理论计算获得优化后的噁霉灵分子结构图如图1所示。

2.1.2 噁霉灵密度泛函理论计算的拉曼光谱和固体标准品的实验拉曼光谱

图2为噁霉灵密度泛函理论计算拉曼光谱图和固体标准品的拉曼光谱图，从图中可以明显看出噁霉灵的拉曼特征峰有600 cm-1、924 cm-1、1 258 cm-1、1 490 cm-1、1 623 cm-1、2 937 cm-1和3 156 cm-1。

取上述7个特征峰的密度泛函理论计算的拉曼位移与固体标准品实验拉曼光谱的拉曼位移，分析这7个特征峰拉曼位移的吻合程度。由图3可知，实验拉曼光谱位移与密度泛函理论计算的拉曼光谱位移线性拟合的R2达到了0.999 36，R2数值越接近1，表示实验与理论计算的拉曼位移吻合程度越高，说明密度泛函理论计算得到的理论拉曼光谱与固体拉曼光谱位移非常接近，密度泛函理论预测的理论拉曼光谱的准确性高，可作为较好的理论依据，后续将进一步对噁霉灵固体标准品峰位的拉曼位移偏移进行分析。

2.1.3 噁霉灵的峰位归属

根据密度泛函理论计算的拉曼光谱图和优化后的分子结构图，可以指认出噁霉灵的拉曼光谱峰位归属（表1），其中位于474 cm-1处的拉曼位移是苯环上的C-C面内弯曲振动和O-H弯曲振动。位于600 cm-1处的拉曼位移是C-C的伸缩振动和苯环上的C-C弯曲振动。位于924 cm-1处的拉曼位移是苯环上的N-O伸缩振动和CH3上的C-H弯曲振动。位于997 cm-1处的拉曼位移是N-O伸缩振动和CH3上的C-H弯曲振动。位于1 031 cm-1处的拉曼位移是苯环上的N-O伸缩振动和苯环上的C-C伸缩振动。位于1 146 cm-1处的拉曼位移是C-H面内弯曲振动和C-C伸缩振动。位于1 258 cm-1处的拉曼位移是O-H弯曲振动和苯环上的C-N伸缩振动。位于1 351 cm-1处的拉曼位移是CH3上的C-H弯曲振动。位于1 442 cm-1处的拉曼位移是CH3上的C-H面内弯曲振动。位于1 490 cm-1处的拉曼位移是O-H面内弯曲振动和苯环上的C-C伸缩振动和苯环上的C-N伸缩振动。位于1 623 cm-1处的拉曼位移是苯环上的C-C伸缩振动和苯环上的C-N伸缩振动。位于2 937 cm-1处的拉曼位移是CH3上的C-H的对称伸缩振动。位于2 982 cm-1处的拉曼位移是CH3上的C-H非对称性伸缩。位于3 156 cm-1处的拉曼位移是C-H的伸缩振动。从理论光谱与实验光谱之间的位移对比，可以看到实验光谱和理论光谱之间的偏移量和偏移率都较小，为后续实验奠定基础。

2.2 表面增强拉曼光谱检测条件的优化

2.2.1 银溶胶体积的优化

加入硝酸银和盐酸羟胺按照不同体积比配制银溶胶增强基底后，噁霉灵的表面增强拉曼光谱见图4。噁霉灵的表面增强拉曼光谱与固体拉曼光谱特征峰略有偏移。例如，600 cm-1处固体特征峰蓝移到607 cm-1处，1 623 cm-1、2 937 cm-1处固体特征峰红移到1 611 cm-1、2 928 cm-1。

选取特征峰最高的2个特征峰607 cm-1、

2 928 cm-1，探究特征峰峰强与不同体积比配制的银溶胶关系。由图5可知，随着硝酸银与盐酸羟胺体积比的增大，两个特征峰（607 cm-1、2 928 cm-1）的峰强在5∶1的体积比时峰强最大，因此按照5∶1体积比配制银溶胶，对噁霉灵的表面增强效果最好。后续实验将一直保持此体积比配制银溶胶。

2.2.2 银溶胶加入量的优化

图6是保持噁霉灵农药10 ?L不变，银溶胶加入量的不同对噁霉灵的表面增强效果也不同。

选取峰强最大的两个特征峰（600 cm-1、2 924 cm-1），探究特征峰峰强与银溶胶不同加入量的关系。由图7可知，银溶胶加入量由2.5 ?L增加到12.5 ?L的过程中，特征峰峰强先增加后减小，在7.5 ?L时特征峰峰强最大，因此加入7.5 ?L的银溶胶增强基底，在保持10 μL噁霉灵农药体积不变的情况下，噁霉灵的表面增强效果最好。

2.3 表面增强拉曼光谱的检测

图8是保持上述最优条件，检测不同浓度的噁霉灵标准溶液的表面增强拉曼光谱图。由图8可知，在噁霉灵标准溶液浓度为10-1 mol·L-1、

10-2 mol·L-1、10-3 mol·L-1浓度时，噁霉灵的各个特征峰较为清晰可见，在10-4 mol·L-1时，604 cm-1、1 628 cm-1、2 941 cm-1处有微弱的特征峰，直到10-5 mol·L-1时，只剩下1 035 cm-1处的特征峰，由于至少需要两个特征峰才能判断这个物质，因此噁霉灵的表面增强拉曼光谱的检测限是10-4 mol·L-1。

图9为在实际食品基质西瓜中通过加标噁霉灵，检测噁霉灵的表面增强拉曼光谱图，在西瓜上清液中添加噁霉灵的浓度为10-1 mol·L-1、10-2 mol·L-1、10-3 mol·L-1和10-4 mol·L-1时，604 cm-1、1 628 cm-1、2 941 cm-1处的特征峰清晰可见。比固体拉曼特征峰600 cm-1、1 623 cm-1、2 937 cm-1向右发生极少的蓝移，可能是西瓜中的成分略微影响了噁霉灵分子振动，而加标浓度为10-5 mol·L-1时已经无法分辨出完整的特征峰峰形，由此得出噁霉靈加标到西瓜中的检测限为10-4 mol·L-1。

3 结论

食品中的农药残留问题一直是影响蔬菜水果食品安全的重要因素，噁霉灵农药是一种广泛应用在瓜果中的杀菌剂，目前关于噁霉灵农药残留的检测方法主要是液相色谱、气相色谱、液相色谱-质谱联用，本文首次使用基于表面增强拉曼光谱计算，通过密度泛函理论计算与固体标准品对比，得到噁霉灵分子的拉曼特征峰和峰位归属，优化表面增强拉曼光谱检测条件，获得不同浓度梯度噁霉灵标准溶液的表面增强拉曼光谱，在实际食品基质西瓜中加标噁霉灵，得到检测限为10-4 mol·L-1，该方法检测限低，无需复杂的前处理，可应用于现场的快速检测，为监管部门提供有效依据。

参考文献

[1]SOLIMAN M，KHORSHID M，EL-MARSAFY A M，

et al.Determination of 10 pesticides， newly registered in egypt， using modified QuEChERS method in combination with gas and liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometric detection[J].Int J Environ Anal Chem，2019，99（3）：224-242.

[2]LIU Y，ZHANG J，SHENG X R，et al.Adsorption and release kinetics， equilibrium， and thermodynamic studies of hymexazol onto diatomite[J].ACS Omega，2020，5（45）：29504-29512.

[3]HAMED S M，HASSAN S H，SELIM S，et al.Differential responses of two cyanobacterial species to R-metalaxyl toxicity： growth， photosynthesis and antioxidant analyses[J].Environmental Pollution， 2020，258：113681.

[4]堵宇，陈福良，张奇珍，等.噁霉灵微球剂高效液相色谱分析方法研究[J].世界农药，2022，44（9）：32-36.

[5]宋强勇，晏姣，曾利红，等.高效液相色谱-串联质谱法测定水稻中稻瘟灵和噁霉灵残留量[J].精细化工中间体，2022，52（3）：77-81.

[6]HASSANEN E I，HUSSIEN A M，HASSAN N H，et al.A comprehensive study on the mechanistic way of hexaflumuron and hymexazol induced neurobehavioral toxicity in rats[J].Neurochem Res，2022，47（10）：3051-3062.

[7]YU Z Q，FAN H C，CAO C H，et al.Development of a continuous flow process for the synthesis of mesotrione[J].Journal of Flow Chemistry，2022，12（2）：1-9.

[8]梁小蕊，丛静娴，李荫，等.基于密度泛函理论的氯氰菊酯振动光谱研究[J].光谱学与光谱分析，2023，43（5）：1381-1386.

[9]NENG J，ZHANG Q，SUN P L.Application of surface-enhanced raman spectroscopy in fast detection of toxic and harmful substances in food[J].Biosensors and Bioelectronics，2020，167：112480.

[10]翟晨，徐田锋，彭彦昆，等.基于银溶胶表面增强拉曼光谱对菠菜毒死蜱农药的快速检测[J].光谱学与光谱分析，2016，36（9）：2835-2840.