中医药调控FoxO3α防治心血管疾病的研究进展

石灿灿,张梦贺,赵 浩,朱 靖

FoxO蛋白家族最初是在果蝇中发现的,目前被证实广泛存在哺乳动物体内,以一个翼螺旋转录DNA结合域为特征,被称为叉头盒蛋白,包括FoxO1(FKHR)、FoxO3α(FKHRL1)、FoxO4(AFX)和FoxO6四个亚型[1]。FoxO3α是其中最重要的成员,主要分布于肌肉、心脏、脾脏和卵巢,位于染色体6q21上,所以FoxO3α不仅可以在蛋白质水平而且可以在基因水平上发挥生物学作用[2]。FoxO3α最初作为肿瘤抑制蛋白而受到广泛的关注,现在越来越多的研究表明,FoxO3α在调节内皮细胞及平滑肌细胞功能、抗动脉粥样硬化、抗心肌细胞纤维化等方面发挥重要作用,是治疗心脏病的潜在靶点。FoxO3α是多个信号转导通路的下游因子,与心血管疾病相关的主要有胰岛素磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)信号通路、核因子-κB(NF-κB)信号通路、沉默信息调节器(SIRT)/FoxO3α信号通路,这些信号转导通路主要通过磷酸化、糖基化、乙酰化和泛素化激活或抑制FoxO3α的活性参与细胞凋亡、自噬、氧化应激、炎症等多个生命活动[3]。

1 FoxO3α的活性调节

FoxO3α转录因子是PI3K/Akt信号通路的关键下游因子,转录活性,受PI3K/Akt的调控,PI3K磷酸化促进Akt向细胞核转移,FoxO3α在细胞核被Akt磷酸化,磷酸化的FoxO3α从细胞核转移到细胞质中,核定位信号被隐藏,并与14-3-3蛋白结合,转录活性变得不活跃[4]。FoxO3α被磷酸化后可与E3泛素连接酶相互作用,从而去磷酸化,从细胞质转移到细胞核,恢复转录活性并激活FoxO3α的下游因子进行活性表达[5]。PI3K/Akt信号通路不仅可以抑制FoxO3α的转录活性,而且受FoxO3α转录因子的反向调节[6]。此外,FoxO3α的转录活性也受到多种激酶的调控,如IκB激酶β(IκB-β)、细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)1、CDK2、细胞外信号调节激酶(ERK)、AMP活化蛋白激酶(AMPK)和c-Jun N末端激酶(JNK)。IκB激酶也可以磷酸化FoxO3α,除了促进磷酸化的FoxO3α向细胞质转移,还可以通过蛋白质系统介导FoxO3α的多泛素化和降解。有研究表明,IκB激酶对FoxO3α的磷酸化独立于PI3K/Akt信号通路[7]。AMPK在营养缺乏或缺氧条件下可以通过磷酸化激活FoxO3α在细胞核中的转录活性,且不影响FoxO3α的核定位,并通过转录触发自噬[8]。研究表明,发生氧化应激时JNK被激活,直接磷酸化FoxO3α或抑制14-3-3蛋白活性,增强其转录活性[9]。SIRT1则通过去乙酰化降低FoxO3α的活性[10-12]。

2 FoxO3α与心血管疾病

2.1 FoxO3α与动脉粥样硬化 血管平滑肌(VSMC)是心血管系统中的主要收缩成分,参与调节心血管系统的血流动力学,在心血管疾病的发生发展中起重要作用,VSMC凋亡可以促进纤维帽结构完整性的丧失,诱导动脉粥样硬化斑块破裂,进而引起脑卒中、心肌梗死和猝死[13]。动脉粥样硬化斑块中的血管平滑肌较正常血管平滑肌对凋亡的易感性增加,在斑块血管平滑肌中胰岛素样生长因子1(IGF-1)介导的存活信号受损、IGF-1受体表达降低,Akt和FoxO3α的磷酸化表达降低,提示在动脉粥样硬化中FoxO3α激活,FoxO3α是介导动脉粥样硬化中的存活信号[14]。

Allard等[15]使用过氧化氢(H2O2)诱导大鼠VSMC凋亡,结果表明IGF1R表达水平调节VSMC在氧化应激下的存活,Akt是IGF1R介导的VSMC存活的主要下游效应物,单独激活Akt足以使VSMC在氧化应激下存活,Akt主要是通过磷酸化FoxO3α或GSK3介导VSMC保护作用。FoxO3α转录因子可激活许多参与细胞死亡的基因,包括FasL、Bim和Puma,GSK3是Bcl-2家族成员Mcl1的主要激酶,磷酸化的GSK3在动脉粥样硬化斑块纤维帽内的VSMC内的表达降低,Akt通过磷酸化FoxO3α降低Bim的表达降低或磷酸化GSK3促进细胞存活;此外,FoxO3α激活可以减少脂质纤维帽面积,增大坏死核心区,诱导VSMC凋亡和细胞外基质降解,促进动脉粥样硬化和内侧变性,促进损伤后的新生内膜生成,明确调控VSMC存活的分子途径可能有助于评估动脉粥样硬化斑块破裂的可能性[16]。

2.2 FoxO3α与动脉微循环 低氧可以诱导心肌微血管内皮细胞(CMECs)功能障碍,因在低氧环境中CMECs产生的血管扩张剂和收缩因子不能平衡,这在心肌缺血损伤的发挥重要作用。Zhang等[17]将CMEC暴露在低氧环境中6～24 h,结果显示缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)和FoxO3α的表达显著增加,Akt和FoxO3α的磷酸化降低,FoxO3α活性增加导致CMEC中的ROS积累,并同时诱导Bcl-2家族蛋白的紊乱,从而导致细胞凋亡。Wang等[18]在大鼠心肌梗死模型中采用抗FoxO3α的抗体进行免疫荧光分析确定FoxO3α在细胞中的位置,结果显示常氧状态下FoxO3α主要定位于CMEC的细胞质中,低氧增加了FoxO3α的核定位和转录活性,LC3基因的表达为时间依赖性增加、微管相关蛋白轻链3Ⅱ(LC3-Ⅱ)积累和p62降解增加,表明低氧应激促进了CMEC中的自噬,FoxO3α是CMEC自噬的潜在诱导剂;抑制自噬可以改善心肌梗死大鼠的心脏功能和冠状动脉内皮依赖性舒张功能,而增加自噬则会产生相反的效果,提示FoxO3α在缺血性疾病中调节冠状动脉微循环功能障碍中的关键作用。Qi等[19]在实验中观察到,在CMEC衰老过程中Akt的激活增加,FoxO3α的激活减少,细胞内抗氧化酶过氧化氢酶(CAT)和超氧化物歧化酶(MnSOD)的活性降低,ROS生成增加,p27Kip1途径激活导致细胞周期停滞在G1期,在衰老的CMECs中添加外源性CAT和MnSOD,虽然有抑制氧化应激的作用,但并不能延缓细胞衰老的进程。氧化应激和细胞周期停滞使CMEC的增殖和血管生成受到抑制,表明FoxO3α通过调节抗氧化剂/ROS/p27kip1信号通路在抑制CMECs衰老过程、促进细胞增殖和血管生成中发挥着重要作用。

2.3 FoxO3α与缺血/再灌注损伤 及时恢复缺血心肌的血流灌注对于解除由冠状动脉狭窄或闭塞引起的心肌缺血缺氧造成的不可逆心肌损害是必要的,但是再灌注治疗可能会使心肌受到更严重的损伤,这种损伤被称为缺血/再灌注损伤。目前,缺血/再灌注损伤的机制尚不明确,可能与自噬和氧化应激、细胞凋亡、钙超载、能量代谢障碍等有关。

活性氧(ROS)积累因可导致线粒体功能障碍被证明与缺血/再灌注损伤有关系。线粒体是细胞能量代谢的主要场所,其中的ROS可在生理条件或受到外界应激刺激时产生,当线粒体中脂质和碳水化合物进行有氧分解或受到氧化刺激时,线粒体中的ROS含量也增加。线粒体产生过量的ROS可氧化损伤线粒体DNA、蛋白质和脂质,所以线粒体既是ROS产生的主要来源,也是ROS的主要损伤靶点,线粒体功能障碍是心肌缺血/再灌注损伤的显著特征,产生过量的ROS可导致线粒体自噬,最终导致细胞死亡[20]。

ROS与各种细胞信号通路和转录因子的激活有关,包括PI3K/Akt、丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)和肿瘤抑制因子p53,较低的ROS水平可以促进细胞存活,而较高的ROS水平促进细胞凋亡。FoxO3α作为这些信号通路共同的下游因子参与调节ROS水平。FoxO3α通过增加ROS清除剂来保护细胞免受氧化应激,从而有助于抑制线粒体自噬导致的细胞凋亡。Kops等[21]研究表明,FoxO3α通过蛋白激酶B(PKB)增加MnSOD的表达,将生物体内正常的代谢产物超氧阴离子自由基催化为过氧化氢和氧,保护静止细胞免受氧化应激。FoxO3α还介导CAT的调节,催化过氧化氢转化为水和氧气[22]。因此,FoxO3α能够调节MnSOD和CAT的表达以减少氧化损伤并增加细胞存活率。除了调节ROS清除剂外,FoxO3α还可以通过抑制线粒体的基因表达减少ROS的产生。FoxO3α通过增加MAX二聚化蛋白(MAD/MXD)的表达和降低c-MyC蛋白的稳定性来抑制线粒体的活性,改变缺氧反应。这些研究结果表明,FoxO3α活化可降低线粒体的表达和线粒体的调节减少ROS的产生[23]。线粒体中存在FoxO3α/MnSOD/CAT级联反应,通过促进ROS解毒、氧化还原平衡和DNA修复来参与细胞应激反应增加细胞生存[24]。另外有一些研究结果不同的文献,Wang等[25]的研究表明,FoxO3α的转录活性被抑制也可以保护细胞免受凋亡,因为SIRT1可以通过降低FoxO3α的乙酰化水平,增加其泛素化水平,下调Bim的表达。Bim是一种重要的凋亡蛋白,活化的Bim可以激活Bax,促进细胞色素C释放和机制凋亡蛋白Bcl-2的表达,保护细胞免受凋亡的影响。心肌梗死时,心肌细胞受到氧化应激作用导致细胞凋亡,丢失的心肌细胞无法恢复,这在心肌重塑中发挥着重要作用。Motta等[26-27]也得出了相同的实验结论,猜测可能因为FoxO3α乙酰基被泛素化和降解会抵消其转录活性。

2.4 FoxO3α与心肌细胞肥大 心肌肥大是大量生理和病理刺激心脏使心脏根据环境进行重塑作出的反应,其特征在于心肌细胞体积增加,心室壁厚度增加、心肌超负荷压力早期增强心肌收缩力,可分为生理性肥大和病理性肥大[28-29]。生理性肥大主要因强烈运动、妊娠和出生后的生长导致以心室壁和室间隔厚度生长为典型特征,心脏的结构和功能是正常的;病理性肥大主要是由神经体液激活、血流动力学负荷的慢性增加及其他心脏的应激反应引起。有临床证据表明,心肌细胞肥大是心血管疾病的住院率和全因死亡率增加的重要预测因素。从机制方面分析,肥大是心肌细胞复杂的生化过程,大量细胞内通路参与心肌细胞肥大和心脏重构的过程[30]。

Meng等[31]观察发现,FoxO3α通过抗氧化应激的方式阻止心肌细胞肥大。氧化应激是线粒体的主要损伤因素,影响线粒体的功能及代谢,心脏受到氧化应激后,心肌细胞线粒体中的心脏肥大调节因子SIRT3升高。此外,β-肾上腺素能受体(β-AR)的慢性激活可诱发细胞凋亡和心脏肥厚,增加SIRT3表达[32]。FoxO3α的转录活性主要与其核质位置有关,SIRT3通过FoxO3α脱乙酰化从而增加FoxO3α的核积累,促进FoxO3α转录因子的转录,有转录活性的FoxO3α通过调节MnSOD和CAT的活性抑制ROS的活性,从而抑制ROS介导的Ras激活,进而抑制GATA4和NFAT的表达,阻止心肌细胞肥大。

Chen等[33]研究发现,AMPK也参与抑制心肌细胞肥大的过程。AMPK激活可以降低磷酸化FoxO3α水平,增加FoxO3α的核转录活性,促进FoxO3α的下游因子泛素连接酶MAFbx的表达,使心肌细胞蛋白质降解,从而抑制心肌细胞肥大,证实了AMPK通过调节FoxO3α/MAFbx信号通路及其下游蛋白降解,抑制血管紧张素Ⅱ(Ang Ⅱ)诱导的培养大鼠心肌细胞肥大。

JNK激活对FoxO3α的转录活性有促进作用,Akt激活对FoxO3α的转录活性有抑制作用。在Chaanine等[34]的研究中,JNK信号通路和Akt信号通路在心力衰竭中均被激活,但是JNK激活可以覆盖Akt对FoxO3α的抑制作用,导致FoxO3α转录活性增加,Bcl-2 EIB 19-kDa相互作用蛋白3(BNIP3)作为FoxO3α的效应子,在心力衰竭中的表达也增加,诱导线粒体自噬,促进细胞调亡,增加心室重构降低心脏功能。

以上研究表明,FoxO3α在不同的信号通路中作用于不同的下游因子,参与氧化应激、自噬等细胞活动,对心室重构的发生发展起促进或抑制作用。

2.5 FoxO3α与动脉血管重塑 大动脉和小动脉血管的病理性重塑导致外周阻力增加是高血压的主要病理机制,尤其小动脉的血管重塑,是高血压疾病的进展标志,且与高血压的严重程度高度相关。Alstad等[35]研究表明,死于循环系统疾病的高血压病人中心力衰竭占40%,脑出血占29%。因此延缓血管重塑进程、控制血压水平对减少心血管事件的发生是非常重要的。

Strassheim等[36]研究发现,PI-103处理的肺动脉血管新生血管内皮细胞(VVECs)中的Akt磷酸化显著减少,FoxO3α核积累增加,转录活性在VVEC群体中持续激活,导致VVECs多个管状结构发育不良,证实了PI3K/Akt途径不仅在VVEC形态反应中发挥作用,还参与了VVEC的有丝分裂过程。FoxO3α作为ATP诱导的PI3K/Akt调节VVEC血管生成的基本调节因子,可能在减轻病理性血管重构方面具有潜在的靶向调节意义。

有研究将5～6个月的雄性小鼠进行颈动脉结扎,与对照血管相比,FoxO3α激活增加了内膜面积和细胞计数,证明FoxO3α在颈动脉结扎后的血管重塑和新生内膜形成中起主要作用[16]。高血压是发生心血管疾病风险的一个独立的预测因子,但是越来越多的高血压病人即使联合使用3种或3种以上的降压药,血压控制仍不达标[37],所以通过逆转与高血压相关的血管重塑减缓高血压的进展对全球健康至关重要,通过干预信号通路对减轻病理性重塑可能是未来治疗高血压的一个新的方向。

3 中医药与FoxO3α

3.1 中医单药与FoxO3α 梁俊清等[38]研究发现,缺氧时细胞内HIF-1α的表达呈现一定程度的升高,磷酸化Akt明显降低,通心络干预后,HIF-1α的表达进一步增加,磷酸化Akt水平明显增多,通心络还可以通过激活PI3K/Akt信号通路抑制FoxO3α的转录活性,使缺氧的内皮细胞Bcl-2和Mcl-1上调,提升细胞活性,改善缺氧导致的内皮细胞损伤,减少动脉粥样硬化的进展。Fu等[39]研究发现,灯盏花素也有抗动脉粥样硬化的作用。灯盏花素是灯盏细辛的一种提取物,具有清除氧自由基和抗氧化作用;灯盏花素可通过调节Hippo/FoxO3α和PI3K/Akt信号通路,显著增加PI3K和p-Akt的蛋白表达水平,增加丝氨酸253处FoxO3α的磷酸化,并促进FoxO3α从细胞核输出到细胞质,抑制FoxO3α的活性表达,提高Bcl2的蛋白表达水平,降低Fas、Caspase-3、Bax和Bim的蛋白表达水平来抑制血管内皮细胞的损伤和凋亡;灯盏花素还可以明显清除血管紧张素Ⅱ诱导的人主动脉内皮细胞(HAEC)损伤模型中的ROS,减少细胞凋亡,从而发挥抗动脉粥样硬化作用。

Xue等[40]的实验研究发现,与缺血/再灌注损伤组相比,人参皂苷Rb2可以有效减少超氧阴离子蓄积,上调SIRT1的表达,增加FoxO3α活性,减少心肌细胞凋亡,减轻氧化应激和炎症,降低心肌梗死面积,降低心肌标志物水平,显著改善心功能不全,增加心脏射血分数,对心脏有保护作用。Yang等[41]研究发现,姜黄素也可通过激活SIRT1信号,上调抗凋亡蛋白Bcl-2的表达,下调促凋亡蛋白Bax的表达,提高线粒体MnSOD活性,防止线粒体产生过多的ROS,从而减轻心肌缺血/再灌注损伤线粒体缺陷,保护细胞在缺血/再灌注损伤过程中免受氧化应激所致的凋亡。Zhang等[42]用丹参酮ⅡA磺酸钠(TST)处理缺血/再灌注损伤的大鼠,发现TST激活Akt/FoxO3α/Bim介导的信号通路,降低FoxO3α的转录活性,减少线粒体内细胞色素C的表达水平,下调降低Bim蛋白表达水平,减少缺血/再灌注损伤诱导的大鼠心肌细胞凋亡,缩小心肌梗死面积,改善缺血/再灌注损伤大鼠的心功能。

董文婷等[43]研究发现,紫檀芪可以通过激活Sirt3/FoxO3α信号通路减轻心肌组织氧化应激损伤,改善大鼠腹主动脉缩窄所致的心肌肥厚。熊朝刚等[44]的实验结果显示,黄芪甲苷通过激活Sirt3抑制血管紧张素Ⅱ诱导的心肌肥大以及氧化应激。Liu等[45]研究发现,FoxO3α是黄芩素的下游靶点,其可促进过氧化氢酶活性以抑制ROS爆发,并在异丙肾上腺素诱导心肌肥厚时激活自噬,促进自噬相关蛋白微管相关蛋白轻链3Ⅰ(LC3-Ⅰ)向LC3-Ⅱ的转化,并相应地下调了p62水平,减轻异丙肾上腺素诱导的ROS的产生,进而抑制心肌肥厚。另一种中药提取物葫芦素B是葫芦素类中的一员,具有抗癌、抗炎、抗脂肪细胞分化的作用。Xiao等[46]研究发现,葫芦素B通过阻断Akt/mTOR/FoxO3α信号通路,增加LC3-Ⅱ、ATG5、ATG7、ATG12和Beclin1的表达,增加自噬,抑制心肌细胞肥大。

3.2 中医复方与FoxO3α 三味檀香散是一种含有活性分子的蒙藏传统药物,由檀香、肉豆蔻、广枣3种药物组成,常用于冠状动脉粥样硬化性心脏病的治疗。Sun等[47]研究发现,三味檀香散通过激活下游的PI3K/Akt/FoxO3α信号通路,促进Akt和FoxO3α的磷酸化,调节下游促凋亡的Bim,减少ST段抬高、病理改变和心肌梗死范围,同时三味檀香散中的3味单药在体外具有不同的抗氧化能力和抑制心肌细胞凋亡的能力,对缺血/再灌注损伤起保护作用。钱梦[48]研究发现,补中益气汤可以通过作用于PI3K/Akt通路,降低磷酸化FoxO3α水平,增加FoxO3α的表达,清除线粒体中过多的ROS,减少细胞氧化应激反应,增加细胞的存活率。

Li等[49]研究发现,AngⅡ以浓度依赖的方式上调CMEC中LC3B-Ⅱ的蛋白水平,增加自噬小体和自溶酶体的数量;Akt是芪苈强心的下游信号通路,芪苈强心可以增加FoxO3α的磷酸化,促进磷酸化的FoxO3α从细胞核转移到细胞质,抑制FoxO3α的转录活性,减弱Ang Ⅱ引起的自噬小体和自溶酶体的聚集,进而下调Ang Ⅱ诱导的自噬,减少内皮细胞凋亡,延缓心力衰竭的进展。张苏洁[50]利用双氧水诱导大鼠心肌细胞的氧化应激反应,检测各组ROS、p-FoxO3α、Sirt4表达水平及凋亡蛋白Bcl-2、Bax、Bim、cleaved Caspase-3的表达,结果发现,与模型组相比,益气活血组ROS、Bax、Bim、cleaved Caspase-3呈剂量依赖的Bcl-2的表达水平呈剂量依赖的方式增加;益气活血组+Sirt4敲减组Bax、Bim、cleaved Caspase-3表达回升但是低于模型组,Bcl-2表达下降但是高于模型组,表明益气活血方通过Sirt4/FoxO3α通路增加FoxO3α的活性减少凋亡蛋白的表达,保护心肌细胞减少氧化应激的损伤,减少炎症反应,抑制细胞凋亡。此外,温肾养血方[51]、六味地黄丸[52]也分别被证实可通过激活PI3K/Akt信号通路作用于FoxO3α,减少细胞凋亡,增加细胞存活率。

4 小结与展望

综上所述,虽然激活FoxO3α的转录活性可以促进许多促细胞凋亡因子诱导细胞凋亡,减少脂质纤维帽面积,增大坏死核心区,调节动脉微循环,加快动脉粥样硬化的进展,但是FoxO3α转录因子的表达也可以调节MnSOD和CAT的活性清除线粒体中过多产生的ROS,有抗氧化应激作用,阻止细胞肥大,减轻病理性血管重构。因此,认为FoxO3α对心血管功能既有保护作用又有损伤作用。一些中药可以通过抑制FoxO3α的活性,减缓心血管疾病的进展,另外也有证据表明中药可以通过激活FoxO3α的转录活性发挥保护心血管的作用,给中医药通过干预FoxO3α治疗心血管疾病提供了客观依据,但基于目前中医药作用于FoxO3α转录因子的研究相对缺乏,对进一步认识中医药对FoxO3α的作用机制造成了很大限制,是当下亟需要探究的问题。