基于网络药理学和分子对接技术探讨小青龙汤治疗慢性支气管炎的分子靶点和作用机制

赖永健，何丽清，储开博，柴 希，柴溥苒

（山西中医药大学，山西 晋中 030619）

慢性支气管炎（chronic bronchitis，CB）是肺部气管和周围组织产生非特异性炎症的临床疾病，其定义是连续2年内每年至少3个月咳嗽咳痰，同时排除导致慢性排痰性咳嗽的其他呼吸道或心脏原因[1]。CB的形成通常与接触刺激性气体或药物有关，但遗传性疾病或呼吸道感染也是发生CB的原因之一。目前研究认为，CB形成主要与肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1（IL-1）、白细胞介素-6（IL-6）等的异常表达有关[2]。常规治疗以预防为主，发作时采用抗生素、支气管扩张药、解痉平喘药等治疗。

根据慢性支气管炎的临床表现，其属于中医学“咳嗽”“喘证”“痰饮”等疾病范畴，临床上治疗咳嗽咳痰、气喘、肺中有寒饮者，当属小青龙汤最妙。现代研究发现小青龙汤具有抗过敏、抗炎、止咳平喘等作用，常用于治疗慢性支气管炎、呼吸道感染、慢性阻塞性肺疾病等呼吸系统疾病。研究表明，小青龙汤可以通过抑制丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路中的细胞外信号调节蛋白激酶（ERK）、Jun氨基末端激酶（JNK）、p38丝裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）等蛋白的表达，改善CB患者的气道炎症反应[3]。但是，小青龙汤治疗CB的其他作用机理及其有效化学成分还需进一步探索。为此，本研究利用网络药理学整合分子对接模拟方法，对小青龙汤治疗CB的作用机制及有效成分进行探讨，为小青龙汤的现代科学研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 小青龙汤活性成分筛选

在HERB数据库（本草组鉴，http：//herb.ac.cn/）进行药物成分的查找[4]，依次检索小青龙汤中麻黄、芍药、细辛、甘草、干姜、桂枝、五味子、半夏的化学成分，筛选去重后，进入PubChem数据库（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）根 据 成 分名称查找“Canonical SMILES”号[5]。然后通过SwissADME 数 据 库（http：//www.swissadme.ch/）筛选活性成分，筛选标准包括：（1）药物动力学选择胃肠道吸收（gatrointestinal absorption）为“high”；（2）类药性5个标准中至少满足其中2个[6-7]，即①氢键供体不超过5个；②氢键受体不超过10个；③脂水分配系数不超过5；④分子量在500以下；⑤可旋转键数不超过10个。

1.2 小青龙汤活性成分的靶点筛选

将筛选出来的活性成分的“Canonical SMILES”号通过 SwissTargetPrediction数据库（http：//www.swisstargetprediction.ch/）进行对应的靶点预测[8]，物种一栏中选择“homo sapiens”（智人），就可以得到该成分对应的靶点（每个成分最多只有100个靶点）。纳入所有概率值大于0的靶点，然后将所有靶点去重后，即得到小青龙汤所有有效成分对应的靶点。

1.3 CB 疾病靶点的筛选

以“chronic bronchitis”为关键词，在TTD数据 库（http：//db.idrblab.net/ttd/）、GeneCard 数 据 库（https：//www.genecards.org/）以 及OMIM 数 据 库（https：//www.omim.org/）进行检索，获得疾病靶点并去重，基于Uniport数据库（https：//www.uniprot.org/）对获得的疾病靶点进行筛选，限定物种为“human”。

1.4 小青龙汤治疗CB 的靶点筛选

将筛选的CB疾病靶点和小青龙汤活性成分靶点导入Venny 2.1.0（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）分析工具，取两者交集即可得两者的共同靶点。

1.5 小青龙汤治疗CB 的蛋白互作网络构建及核心靶点的筛选

将得到的共同靶点导入STRING 数据库（https：//cn.string-db.org/），最低相互作用阈值设为0.9，构建蛋白互作网络。将蛋白互作网络信息及活性成分信息导入Cytoscape 3.8.2 软件，在CytoNCA 插件中勾选中介中心性（betweenness centrality，BC）、紧密中心性（closeness centrality，CC）、度中心性（degree centrality，DC），在结果中按DC≥2×DC中位数，BC和CC大于或等于其中位数进行筛选[9]，得到最终核心靶点，同时获得有效活性成分节点度值（Degree）。

1.6 小青龙汤治疗CB 靶点基因本体功能富集分析（Geneontology，GO）和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析

将筛选出来的核心靶点，利用Metascape数 据 库（https：//metascape.org/）进 行GO 功 能 和KEGG通路富集分析，分别将分析得到的生物过 程（biological process，BP）、细 胞 组 成（cellular component，CC）、分子功能（molecular function，MF）数据取前20 条导出，算出-LogP 值，然后录入GraphPad Prism 9.3.1软件中，获取GO功能分析图；选取排名前20条KEGG通路，将数据导入微生信（http：//www.bioinformatics.com.cn/）分析工具，绘制气泡图。

1.7 小青龙汤活性成分与核心靶点分子对接

取节点Degree值排名前10位的活性成分，在PubChem数据库下载对应成分的2D结构，保存为sdf格式；再利用Chem 3D软件获得对应的3D结构，并保存为mol2格式。取排名前10位的最终核心靶点，分别在PDB 数据库（https：//metascape.org/）检索，获得靶点的3D结构，保存为pdb格式，利用PyMOL 2.6.0软件进行去水、去残基配体操作。利用AutoDock Tools 1.5.7软件对活性成分和靶点进行对接验证，最后用PyMOL 2.6.0软件进行可视化处理。

2 结 果

2.1 小青龙汤活性成分及靶点筛选

从HERB 数据库得到小青龙汤活性成分2271个，其中，麻黄485个，桂枝268个，干姜269个，细辛256 个，半夏179 个，甘草401 个，白芍242 个，五味子171 个，合并去重后共获取活性成分1837 个；将这些成分通过SwissADME数据库进行筛选，得到活性成分共1141个，其中，麻黄254 个，桂枝153 个，干姜106 个，细辛115，半夏96个，甘草222 个，白芍105 个，五味子90 个，去重后共987个活性成分；将这些活性成分输入SwissTargetPrediction数据库进行对应靶点筛选，去重后共得到1411个靶点。

2.2 小青龙汤治疗CB 的靶点筛选

以疾病“chronic bronchitis”为关键词进行检索，GeneCards 数据库有1194个靶点，OMIM数据库80个，TTD数据库2个，去重后共1267个靶点。将小青龙汤活性成分靶点和CB疾病靶点导入Venny 2.1.0分析工具，获得共有靶点261个。结果见图1。

图1 小青龙汤治疗CB 的靶点韦恩图

2.3 小青龙汤治疗CB 的蛋白互作网络构建及核心靶点的筛选

在 STRING 数据库获得共有靶点的蛋白相互作用数据信息，将其与活性成分信息导入Cytoscape 3.7.2软件中绘制PPI网络。PPI网络中共有260个节点（靶基因），通过4703条边发生相互作用，舍弃1个独立基因靶点MYLK2，得到小青龙汤治疗CB的活性成分108 个，按Degree值排名取前20 位，结果见表1。按DC≥2×DC中位数，BC和CC大于或等于其中位数，筛选得到最终核心靶点53个，结果见表2、图2。节点大小及颜色亮度与Degree值成正比，圆点越大，颜色越深，说明Degree值越大，靶点与靶点之间的相互作用越强。Degree值排名前10 位的为肿瘤坏死因子（TNF）、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）、血清白蛋白（ALB）、IL-6、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（AKT1）、细胞肿瘤抗原p53（TP53）、白细胞介素-1β（IL-1β）、表皮生长因子受体（EGFR）、信号转导及转录激活蛋白3（STAT3）、血管内皮生长因子A（VEGFA），提示其可能是小青龙汤治疗CB的关键核心靶点。

表2 小青龙汤治疗CB 的核心靶点信息

图2 小青龙汤治疗CB 核心靶点PPI 网络

2.4 小青龙汤治疗CB 靶点GO 功能富集分析

将小青龙汤治疗CB 的核心靶点导入Metascape 数据库进行GO 功能富集分析，共获得生物过程（BP）237 个，主要涉及炎症反应（inflammatory response）、细胞活化（cell activation）、免疫反应的正向调节（positive regulation of protein phosphorylation）、蛋 白 质 磷 酸 化（protein phosphorylation）等过程；细胞组成（CC）107 个，主要涉及细胞顶端（apical part of cell）、受体复合物（receptor complex）、染色体（chromosome）、囊泡腔（vesicle lumen）、细胞质核周区（perinuclear region of cytoplasm）等；分子功能（MF）109个，主要涉及蛋白激酶活性（protein kinase activity）、蛋白质结构域特异性结合（protein domain specific binding）、内肽酶活性（endopeptidase activity）、细胞因子受体结合（cytokine receptor binding）等。将分析数据导入GraphPad Prism9.3.1软件中，获取GO功能富集分析图。结果见图3。

图3 小青龙汤治疗CB 核心靶点GO 功能富集分析

2.5 小青龙汤治疗CB 靶点KEGG 通路富集分析

将小青龙汤治疗CB 的核心靶点导入Metascape 数据库进行KEGG功能富集分析，共有182条通路信息，主要涉及癌症通路（pathways in cancer）、钙信号通路（calcium signaling pathway）、神经活性配体-受体相互作用（neuroactive ligand-receptor interaction）、NF-κB信号通路（NF-kappa B signaling pathway）、中性粒细胞胞外陷阱形成（neutrophil extracellular trap formation）、坏死性凋亡（necroptosis）等信号通路。将排名前20条通路数据导入微生信分析工具，进行可视化。结果见图4。

图4 小青龙汤治疗CB 核心靶点KEGG 通路富集分析

2.6 小青龙汤有效活性成分与核心靶点分子对接

取小青龙汤排名前10 位的核心靶点和排名前10 位的有效活性成分，利用AutoDock Tools 1.5.7 软件进行分子对接，结果见图5。数值大小和颜色深浅代表结合的能量强弱，数值越小，颜色越深，结合需要的能量越小，发生相互作用的可能性越大。结合能≤-5.0 kJ/mol表示结合性能良好。11-甲氧基胡蔓藤碱乙（11-methoxyhumantenine）与GAPDH、AKT1 对 接能 量 分 别 为-9.1 kcal/mol、-9.4 kcal/mol；3-甲氧基草棉黄素（3-Methoxyherbacetin）与GAPDH、AKT1 对 接 能 量 分 别 为-9.0 kcal/mol、-9.2 kcal/mol。对以上4组结果进行可视化，结果见图6。

图5 小青龙汤排名前10 位核心靶点和有效活性成分分子对接热图

图6 分子对接模式图

3 讨 论

通过小青龙汤治疗CB的蛋白互作网络信息，获得排名前10位的有效活性成分为1-（3H）异苯并呋喃酮、11-甲氧基胡蔓藤碱乙、3-甲氧基草棉黄素、醋酸、醋酸法呢醇、邻苯二甲酸二丁酯、7-去甲基软木花椒素、2-十五烷酮、α-亚麻酸以及1-苯基-1，2-丙二酮，这10种有效成分都是麻黄中的成分，醋酸是麻黄和桂枝共有的成分，邻苯二甲酸二丁酯既属于麻黄、桂枝，又属于甘草、干姜，证实麻黄是小青龙汤的君药以及麻黄多成分、多靶点药理作用的特点，说明麻黄治疗肺系疾病除麻黄碱和伪麻黄碱以外，可能其他成分也发挥重要作用。1-（3H）异苯并呋喃酮属于异苯并呋喃酮衍生物中的一种，具有抗菌和抗氧化活性[10]。

通过蛋白互作网络信息，得到前10个核心靶点，包括TNF、GAPDH、ALB、IL-6、AKT1、TP53、IL-1β、EGFR、STAT3、VEGFA。TNF是免疫系统重要的细胞因子，TNF信号通路的激活与细胞凋亡、细胞成活、炎症反应和免疫功能等生物过程密切相关[11]。IL-6是白细胞介素-6的基因靶点，常参与炎症反应、体液免疫反应[12]，参与急性炎症反应的积极调节，是细胞急性期反应的有效诱导剂[13]。AKT1参与细胞对表皮生长因子和神经生长因子刺激的反应、细胞增殖及细胞凋亡等过程[14-15]。GAPDH主要参与体液免疫反应和NF-κB信号传导等[16-17]。

郑爽等[18-19]研究认为小青龙汤治疗慢性肾小球肾炎（CGN）主要涉及TNF信号通路、磷脂酰肌醇3-激酶/丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（PI3K/AKT）信号通路、VEGFA信号通路，这与本研究结果有共同之处。通过这些共有靶点通路，或许可以阐述小青龙汤“异病同治”及中医“肺肾相关”的机理。

通过对小青龙汤治疗CB的靶点进行GO功能富集分析发现，靶点主要与细胞炎症反应、细胞活化、细胞免疫反应等过程有关。KEGG通路富集分析结果显示，小青龙汤治疗CB的相关信号通路主要涉及NF-κB信号通路、中性粒细胞胞外陷阱形成、坏死性凋亡等。NF-κB是一个高度保守的转录因子家族，调节许多重要的细胞行为，特别是炎症反应、细胞生长和凋亡[20]，涉及癌症、关节炎和哮喘等疾病[21]。中性粒细胞是人体抵御微生物病原体的第一道防线，同时可介导组织损伤和无菌性炎症。在其启动时，会释放中性粒细胞胞外陷阱以限制病原体传播并杀死微生物[22]。因此NF-κB信号通路、中性粒细胞胞外陷阱形成、坏死性凋亡等信号通路的表达可能与慢性支气管炎的炎症反应和免疫功能密切相关。

4 结 论

通过网络药理学和分子对接研究，推测小青龙汤治疗CB的作用机制可能是小青龙汤中的11-甲氧基胡蔓藤碱乙、3-甲氧基草棉黄素、7-去甲基软木花椒素等有效成分作用于AKT1、GAPDH、IL-6、TNF等关键靶点，进而对NF-κB信号通路、中性粒细胞胞外陷阱形成、坏死性凋亡等信号通路进行调控而产生疗效。同时，也提示小青龙汤基于多成分、多靶点、多通路治疗慢性支气管炎的特点，因此有必要继续对其机理进行更深入的研究和验证。