不同灭菌方式、蛋白质含量饲料对大小鼠生长发育及生化指标的影响

2023-08-17王晓峰徐骋昊刘奕廷张子英朱晓伟

现代畜牧兽医 2023年7期

王晓峰，徐骋昊，刘璇，刘奕廷，张子英，张楠，朱晓伟，韩帅

（内蒙古医科大学，内蒙古呼和浩特 010110 ）

实验动物是生命科学研究的重要材料和支撑，其生命中各项生理活动均与营养紧密相关，如生长、繁殖、疾病防御等。实验动物个体乃至群体健康均可能受到实验动物饲料质量以及成分配比的影响，而这些影响因素很可能成为基础研究中的复杂变量，进一步影响研究的再现性和可重复性[1]。将实验动物饲料对动物机体的影响控制在一定可知范围内是保证科研数据严谨准确的前提[2]。

实验动物营养质量控制是实验动物标准化的一项重要内容[2]。为标准化控制实验动物的营养摄入，实验动物饲料均为全价饲料。实验动物饲料原料控制精细，严格按照国家标准使用规定的原料类型。但目前我国实验动物饲料生产厂家的原料采购途径不同，原料使用受到市场价格波动影响，而且不同厂家的饲料配方不同，同一厂家不同的产品类型，乃至不同批次的饲料成分也会存在不同程度的变化。这些变化虽然在国标范围内，但也可能造成实验动物机体和待测指标改变进而影响试验结果。目前实验动物饲料灭菌方式通常采用60Co-γ 射线灭菌和高温高压灭菌，而这两种灭菌方式对饲料营养的损耗程度及饲料的熟化度、硬度等的影响也不同，均可能造成实验动物个体差异。本试验在60Co-γ 射线灭菌饲料和高温高压灭菌饲料等两种不同灭菌条件下，选取市场上两种不同蛋白质含量的实验动物饲料对SPF 大小鼠生长发育和各项生化指标的进行动物健康评价，以期为确定不同灭菌方式和蛋白质含量对大小鼠健康程度的影响提供参考。

1 材料方法

1.1 试验饲料

试验选用内蒙古地区常用的某省某公司的两种不同鼠饲料，具体成分见表1、表2。检测标准为GB/T 6438—2007。60Co-γ 辐照灭菌（20 kGy），高温高压灭菌（121 ℃、0.14 MPa、20 min）。

表1 大鼠、小鼠饲料营养水平Tab.1 Composition of feed for mice and rats

表2 大鼠、小鼠饲料氨基酸含量Tab.2 Amino acid content in rat and mice feed单位:g/kg

1.2 试验设计

SPF 级KM 小鼠40 只，Wistar 大鼠64 只，均购自内蒙古医科大学实验动物中心(生产许可证号:SCXK-2020-0001；批准号:京动字8910M047），自由饮食，饲养环境符合GB-14925—2010 试验动物环境及设施要求。21 日龄离乳后适应性饲养3 d，采用随机分组法进行分组，KM 小鼠、Wistar 大鼠各自均分为4 组:60Co-γ 灭菌高蛋白组（CoG 组）、60Co-γ 灭菌低蛋白组（CoD 组）、高温高压灭菌高蛋白组（TG 组）、高温高压灭菌低蛋白组（TD 组），各组中Wistar大鼠为16只，KM小鼠为10只，且每组大鼠、小鼠雌、雄各半。小鼠试验期为2021 年12 月9 日至2021 年12 月26 日，共18 d；大鼠饲养试验为2022 年5 月16 日至2022年7月23日，共68 d。

1.3 测定指标及方法

1.3.1 体重差值和脏器比

试验第1、4、7、9、12、14、16、18 d 9:00 称量小鼠体重，计算相邻两次测量的体重差值，共计8次。试验结束后小鼠进行安乐死，解剖后取肝、肾、心脏、脾、子宫、睾丸、回肠、胃、胰腺和胸腺称重，计算脏器指数。

试验第1、4、7、15、23、33、47、57、68 d 9:00称量大鼠体重，共计9次，计算相邻两次测量的体重差值。大鼠CO2安乐死后解剖，取肝、肾、脾、胃和胸腺称重，计算脏器指数。

式中:m1为脏器重，m为体重，m3为后一次所测量的体重，m2为前一次所测量的体重。

1.3.2 血尿成分分析

试验结束后剩余大鼠中每组随机选择10 只（雌、雄各半），麻醉取血液，2 675 r/min 离心10min，取血清，使用DI600/800 SOP 全自动生化仪（江苏英诺华医疗技术有限公司）测试大鼠血液指标:谷丙转氨酶（ALT）、谷草转移酶（AST）、碱性磷酸酶（ALP）、谷氨酰胺转移酶（GGT）、总蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、高密度脂蛋白（HDL-C）、直接胆红素（DBIL）、尿素（UREA）、葡萄糖（GLU）、尿酸（UA）、胆固醇（TC）、总胆汁酸（TBA）、免疫球蛋白G（IgG）、免疫球蛋白A（IgA）、镁（Mg）、甘油三酯（TG）、糖化血清蛋白（FMN）、肌酐（CREA）、C反应蛋白（CRP）、前白蛋白（PA）。

试验结束后每组随机选取3 只雄性大鼠、小鼠进行尿液成分检测。使用半定量尿液试纸（型号:8U12A，威海康正医疗器械科技有限公司）检测相关指标:白细胞、亚硝酸盐、尿胆原、蛋白质、潜血、尿比重、酮体、胆红素、葡萄糖、抗坏血酸、微量白蛋白。操作方式参考说明书。

2022年7月24日至2022年8月11日，TG组和CoG组饲喂CoD 组饲料，之后每隔6 d 用半定量试纸测量一次尿液，记录测试指标变化，共测试3次。指标包括:亚硝酸盐、蛋白质、微量白蛋白。

1.4 数据统计与分析

试验数据采用SPSS 26.0 进行处理分析，独立样本T检验、非参数秩和检验进行差异显著性分析。结果以平均值表示，P＜0.05表示差异显著，P＜0.01表示差异极显著。

2 结果与分析

2.1 不同饲料对小鼠、大鼠体重差值的影响（见表3、表4）

表3 不同饲料对KM小鼠体重差值的影响Tab.3 Effect of different feeds on weight difference of KM mice单位:g

表4 不同饲料对Wistar大鼠体重差值的影响Tab.4 Effect of different diets on weight difference of Wistar rats单位:g

由表3、表4可知，1～4 d和5～7 d饲喂低蛋白饲料小鼠体重差值显著高于高蛋白饲料小鼠（P＜0.05）。其他时段体重差值差异均不显著（P＞0.05），16 d 前高蛋白饲料饲喂小鼠体重差值低于低蛋白，16 d之后高于低蛋白。8～15 d、16～23 d饲喂低蛋白饲料大鼠体重差值显著低于高蛋白饲料饲喂的大鼠（P＜0.05）。

饲料不同灭菌方式对小鼠体重差值无显著影响（P＞0.05），但高温高压灭菌饲料饲喂的试验鼠体重差值略高于60Co-γ 灭菌饲料；60Co-γ 灭菌饲料饲喂大鼠5～7 d、24～33 d、34～47 d 的体重差值极显著高于高温高压灭菌饲料（P＜0.01）。

除1～4 d 小鼠和5～7 d 大鼠外，雄性大鼠、小鼠体重差值均显著或极显著高于雌性（P＜0.05或P＜0.01）。

2.2 不同饲料对小鼠、大鼠脏器指数的影响（见图1、图2）

图1 不同饲料对KM小鼠脏器指数的影响Fig.1 Effect of different feeds on organ index of KM mice

图2 不同饲料对Wistar大鼠脏器指数的影响Fig.2 Effect of different feeds on organ index in Wistar rats

由图1可知，不同蛋白水平，低蛋白饲料饲喂小鼠的胰腺指数显著高于高蛋白饲料饲喂小鼠（P＜0.05）。雄性小鼠肝脏指数、胰腺指数极显著高于雌性小鼠（P＜0.01），胸腺指数极显著低于雌性小鼠（P＜0.01），肾脏指数显著高于雌性小鼠（P＜0.05）。

由图2可知，不同蛋白水平、不同灭菌方法，大鼠脏器指数差异均不显著（P＞0.05）；雌性大鼠胃指数、肝脏指数、胸腺指数显著高于雄性（P＜0.05）。

2.3 不同饲料对Wistar大鼠血液指标的影响（见表5）

表5 不同饲料对Wistar大鼠血液生化指标的影响Tab.5 Effect of different feeds on blood biochemical indexes of Wistar rats

由表5可知，60Co-γ灭菌饲料饲喂的大鼠血液ALT活性和CRP的含量显著低于高温高压法灭菌饲料（P＜0.05），UA、CREA含量显著高于高温高压灭菌饲料（P＜0.05）。

雌鼠血液ALP 活性及TP、UREA、IgG 含量显著高于雄性（P＜0.05），GGT活性及DBIL、TG、CRP、Mg2+的含量显著低于雄性（P＜0.05），ALB、HDL-C、GLU、TC含量极显著高于雄性（P＜0.01），TBA含量极显著低于雄性（P＜0.01）。

2.4 不同饲料对小鼠、大鼠尿液成分的影响（见表6、表7）

表6 不同饲料对小鼠、大鼠尿液检测结果的影响Tab.6 Effect of different feeds on urine test results in mice and rats

表7 转喂低蛋白饲料后Wistar大鼠尿液成分动态变化Tab.7 Dynamic changes of urine composition in Wistar rats after being fed low protein diet单位:mg/L

由表6 可知，各组小鼠尿蛋白均为1.50 mg/L，尿微量白蛋白均为1 500 mg/L。大鼠CoG 组、TD 组、TG 组尿蛋白质分别为1.10、0.70、1.10 mg/L，尿微量白蛋白均为1 500 mg/L。大鼠CoD组尿蛋白质0.05 mg/L，微量白蛋白100 mg/L；尿胆原、GLU、维生素C均有阳性检出。

由表7 可知，CoG 组和TG 组大鼠转喂低蛋白饲料后第12 d 时尿蛋白质阴性，尿微量白蛋白降至300 mg/L；第18 d 时尿蛋白质阴性，尿微量白蛋白为100 mg/L；第24 d时，尿蛋白质和尿微量白蛋白均为阴性。

3 讨论

3.1 不同饲料对大小鼠生长变化的影响

Sijbesma 等[3]研究表明，高蛋白饮食体重和体脂百分比低于低蛋白饮食，且高蛋白饮食可降低GPRC6a敲除和野生型小鼠的体重增加和食物摄入量[4]。本试验中，小鼠高蛋白水平体重差值在第7 d显著低于低蛋白水平体重差值，其余时间体重差值差异无统计学意义，高蛋白水平饲料饲喂的大鼠第7～15 d、15～23 d 的体重差值均低于低蛋白水平。这与小鼠生长变化具有一定相似性，均在生长发育的中期出现，可能是高蛋白质消化后产生大量的肽，阻断存在于胃肠道主要血管壁上的阿片受体从而抑制食欲。同样有研究表明，在高脂高蛋白特制饲料喂养情况下，大鼠采食量明显下降，体重增速缓慢，出现厌食相关症状，且下丘脑 CCK-8 蛋白相对表达量增高，NPY 蛋白相对表达量降低[5]。

60Co-γ灭菌处理饲料饲喂的大鼠第4、23、33 d的体重差值显著低于高温高压灭菌的大鼠，这可能是60Co-γ与高温高压对饲料中的氨基酸和维生素的破坏程度不同所致，而小鼠未出现这种情况有可能是大鼠对氨基酸和维生素的需求量更高所致。

经数据统计分析，小鼠性别方面，第1 d时雄性体重显著高于雌性，但到第7 d 时两者体重增长无差异，又在7 d之后显著性逐渐增加，12 d开始差异性显著。这可能与小鼠性别偏向表达的时间差异有关。而本试验大鼠的生长数据统计分析，在第1 d 时，雄鼠体重明显高于雌鼠，但第7 d两性别体重增长无差异性，15 d之后雄鼠体重增长再次明显高于雌鼠，生长趋势与小鼠相同。

3.2 不同饲料对大小鼠脏器指数的影响

本试验中，高蛋白水平饲养的小鼠的胰脏指数显著低于低蛋白水平，其原因可能是高蛋白膳食通过破坏胰腺氧化和抗氧化平衡状态，增加自由基对胰腺内外分泌功能的氧化应激损伤。而高蛋白水平小鼠子宫指数略低于低蛋白水平小鼠，可能是高蛋白的摄入抑制食欲从而降低采食量而导致子宫发育轻微受限。60Co-γ 灭菌处理饲料饲喂小鼠脾脏指数小于高温高压灭菌方法，原因可能是60Co-γ破坏了饲料中小鼠脾脏所需的物质，确定其具体原因还需进一步试验加以验证。

不同性别的小鼠除心脏、脾脏、肺、胃等器官的指数差异无统计学意义，雄性小鼠的肝脏、胰腺、肾脏、回肠等脏器指数均大于雌性小鼠，胸腺指数低于雌性小鼠。其中胸腺指数可能和miR-27b-3p和miR-378a-3p受雌激素所调控有关[6]，胰腺指数的差异可能和基因Slc26a9 有关[7]。而雌性大鼠的肝脏、胃、胸腺等脏器指数均大于雄性大鼠，其结果与小鼠有所不同，其具体原因还需进一步研究。

3.3 不同饲料对大鼠血液生化指标的影响

本研究中，高蛋白水平摄入的大鼠血液ALT、ALB、TBA略高于低蛋白水平，这可能是高蛋白的摄入导致机体为消化蛋白质而增加TBA的含量，进一步导致体内对氨基酸代谢增加，使ALT 活性、ALB 含量增加。有研究表明，高蛋白饮食可对肝脏的功能能力产生负面影响，导致转氨酶活性增加，TC 和蛋白质代谢发生变化[8]。FMN 检测可准确反映血糖水平，本研究中高蛋白日粮饲喂的大鼠血液FMN含量略高于低蛋白日粮饲喂的大鼠，表明大鼠摄取高蛋白后可使血糖升高。

由于灭菌方式会对饲料中的维生素造成破坏，本试验中高温高压灭菌日粮饲喂的大鼠血液CREA 含量低于60Co-γ灭菌法，表明60Co-γ灭菌法可能使大鼠的肾脏功能下降。同时高温高压法灭菌日粮饲喂大鼠血液CRP、ALP、DBIL 也高于60Co-γ 灭菌法，表明大鼠肝脏功能下降，原因可能是高温高压破坏了某种肝脏所需的维生素成分，导致了肝脏的损伤。有试验发现，维生素B6可在大脑衰老过程中恢复ALT的活性[9]。Haraikawa等[10]研究发现，维生素K1或维生素K2能够提高大鼠ALP 活性。本研究中，60Co-γ 法灭菌饲料饲喂的大鼠UA 含量显著高于高温高压法饲料饲喂的大鼠，可能与高温高压法对B族维生素的破坏有关。有研究表明，叶酸可通过降低黄嘌呤氧化酶产生氧自由基及过氧化物的能力，抑制黄嘌呤氧化酶的活性，从而减少UA生成。而且维生素B12会加强叶酸的利用率从而降低UA的产生；同时缺乏维生素B2可能会影响到黄嘌呤氧化酶的活性，进而影响机体UA 水平；维生素B6也可参与叶酸和维生素B12的代谢从而影响UA的生成，进一步说明高温高压破坏维生素导致肝脏受损。本研究中，60Co-γ灭菌饲料饲喂的大鼠血液DBIL含量高于高温高压饲料饲喂的大鼠，原因可能是对维生素的破坏导致肝脏损伤，导致肝脏对胆红素的代谢能力下降。综上，这两种灭菌方法对维生素的破坏均可对肝脏代谢产生一定影响，并且高温高压对大鼠肝脏的影响更大。

本研究中，雄性大鼠GGT、DBIL、TBA、CRP均高于雌性大鼠，说明雄性大鼠的代谢比雌性大鼠旺盛。本试验中，雄性大鼠的Mg2+的浓度远高于雌性大鼠，有研究表明，高浓度Mg2+组大鼠股骨生长速度加快，并且Mg2+能够减轻5/6肾切除大鼠胸主动脉血管钙化，促进骨骼生长[11]，这可能是雄性大鼠体重增长高于雌性大鼠的原因之一。雌性大鼠血液IgG含量高于雄性大鼠，研究显示赖氨酸摄入量与大鼠血浆IgG 的分数合成率（FSR）呈正相关关系[12]，推测雌性大鼠可能对饲料中的赖氨酸更加敏感。雌性大鼠HDL-C显著高于雄性，可能和雌激素诱导HDL-C合成有关。雌性大鼠血液UREA含量显著高于雄性，原因可能是肝脏内UREA循环的关键酶（氨基甲酰-P合酶1、精氨酸-琥珀酸合酶和精氨酸酶）的表达活性与基因表达相关，通常表现为雄性因饮食而降低更为显著[13]。雌性大鼠血液TC 含量显著高于雄性，这可能是不同性别的大鼠对酪蛋白的敏感性不同。Torres-Villalobos 等[14]研究显示，酪蛋白饮食大鼠的血清和肝脏TC 含量更高。雌性大鼠血液TP、ALB含量显著高于雄性大鼠，与前人研究结果相似[15]。雌性大鼠血液GLU含量极显著高于雄性大鼠，这可能是雌性大鼠白色脂肪组织（WAT）基因表达更活跃。Rotondo等[16]研究表明，WAT 可吸收并用于脂肪合成生成多余的膳食GLU，且雌性WAT基因表达比雄性高。

3.4 不同饲料对大小鼠尿液成分的影响

本试验通过检测尿液，进一步验证不同饲料对大小鼠生长发育的影响，发现在高、低蛋白水平下小鼠均有大量蛋白尿，其尿蛋白均为1.5 mg/L，尿微量白蛋白均为1 500mg/L，并且在高、低蛋白水平下小鼠血液氨基酸成分没有明显差异，这表明两种蛋白质含量可能均高于小鼠生长发育所需要的蛋白质含量，并且在一定程度上高蛋白质可能对肾脏造成损伤。同时大多数小鼠出现尿胆原阳性，其可能血胆红素含量增高，表明肝脏出现炎症反应，这可能是小鼠肝脏无法代谢大量蛋白质而出现肝脏的损伤。对于大鼠尿液成分检测分析中，第一次检测大鼠尿液后发现，高蛋白水平和低蛋白水平均有尿蛋白质和尿微量白蛋白，但其低蛋白水平不同程度的等于或低于高蛋白水平的尿蛋白含量。之后大鼠TG组和CoG组转饲喂CoD饲料，其尿蛋白含量明显下降，最后一次检测其尿蛋白质和尿微量白蛋白阴性。表明TG和CoG组提供了超过大鼠所需要的蛋白质，并且可能已经对大鼠肾脏造成一定的损伤。另外，本实验还发现从低蛋白水平饲喂大鼠的第一次检测尿液成分中发现抗坏血酸等其他成分的阳性，这可能是一次偶然的结果，需要进一步实验证明其结果。

本试验发现，高温高压灭菌法饲喂的部分大鼠会出现尿亚硝酸盐阳性，这可能是高温高压造成饲料水分不断蒸发，硝酸盐的浓度相对地增加并且受热分解变成了亚硝酸盐有关。但高温高压法下饲喂小鼠并没有出现尿亚硝酸盐阳性，可能是小鼠进食含量较小的原因，当前方法无法检测出结果，但还需进一步证明。本研究结果显示，饲料的灭菌方式和蛋白水平对大小鼠的健康均有不同程度的影响，应予以重视，为保证研究的准确性，可实时监测其血液和尿液相关指标。