中西药联用对禽致病性大肠杆菌病的治疗作用

吴逸琳，苏海伦，姚润艺，王帅琪，张占丽，左 丽*，张永英

（ 1． 河北工程大学生命科学与食品工程学院，河北 邯郸 056000 ；2． 馆陶县农业农村局，河北 邯郸 057150 ）

近年来，多重耐药大肠杆菌的出现和广泛传播给疾病治疗带来了巨大困难[1]，使抗菌药物的治疗效果越来越差。禽致病性大肠杆菌病的治疗尤为困难，传统的抗生素疗法效果甚微[2-3]。因此研究人员将重点放在寻找新的治疗方法。研究表明，中药具有多靶点、无毒副作用等优点[4]，用于治疗细菌性疾病具有良好的效果。但一种中药含有多种有效成分，成分及药效受到产地、炮制方式等多种因素的影响，限制其在临床中的应用[5]。中药有效成分具有多靶位效应，对于不同耐药机制介导的大肠杆菌耐药性具有消除效果[6]，更具有实际应用价值。本研究利用中药有效成分形成组合物，并对禽致病性大肠杆菌病进行治疗，为其临床治疗多重耐药大肠杆菌病提供新思路。

1 材料与方法

1.1 试验材料

血清型为O78 的禽致病性大肠杆菌由河北工程大学禽病工程技术研究中心保存[7]。柠檬酸、芦丁、小檗碱、头孢噻肟等标准品购自北京索莱宝科技有限公司。三黄汤购自邯郸市同仁堂药店。

1.2 试验方法

1.2.1 溶液配制

头孢噻肟、柠檬酸溶解于100 mL无菌蒸馏水中，芦丁和小檗碱溶解于100 mL 10% DMSO中，0.22 μm滤膜过滤除菌。

1.2.2 中药有效成分对大肠杆菌最小抑菌浓度（MIC）测定

将大肠杆菌纯化后采用二倍稀释法测定各中药有效成分MIC。在96 孔板中将各中药有效成分2 倍倍比稀释为10个稀释度，1～10孔依次加入浓度为1×106CFU/mL菌液100 μL。第11 孔加入100 μL 菌液为阳性对照组，第12 孔加入100 μL LB 为阴性对照组，每组3 个重复，37 ℃培养24 h后观察结果，以无菌生长的最低稀释度定为该菌的MIC值。

1.2.3 亚抑菌浓度（1/2 MIC）组合物处理

大肠杆菌接种于LB 液体培养基，37 ℃、180 r/min 摇床培养4.0～4.5 h，比浊仪调整菌液浓度至1×106CFU/mL，然后加入终浓度为1/2 MIC 的中药组合物（柠檬酸、芦丁、小檗碱按2∶1∶2 体积比组合），37 ℃、180 r/min 摇床培养18～24 h，重复以上步骤连续作用72 h。

1.2.4 大肠杆菌动物模型建立

选择1 日龄蛋雏鸡75 只，适应性饲养6 d，7 日龄时用血清型为O78 且对头孢噻肟耐药的鸡源大肠杆菌攻毒。记录48 h 内死亡率，按照改良寇氏法计算半数致死量（LD50）。大肠杆菌动物模型试验设计见表1。

表1 大肠杆菌动物模型试验设计Tab.1 Grouping of E. coli animal models

1.2.5 动物回归试验细菌分离鉴定

剖检攻毒后的蛋雏鸡，无菌操作从病变脏器中分离细菌，进行生化试验，确定细菌种属，通过玻片凝集试验鉴定血清型，检测分离菌株和攻毒菌株是否一致。

1.2.6 组合物治疗试验

选择1 日龄蛋雏鸡180 只，随机分成6 组（试验设计见表2），适应性饲养6 d。7 日龄时，使用浓度为1.102×108CFU/mL O78 型大肠杆菌攻毒。从攻毒时开始采用饮水给药的治疗方式；针对临床症状严重、不能正常饮水的鸡进行人工灌服，剂量为20 mL/kg，2次/d。记录各组鸡的发病情况，统计治愈率、有效率、死亡率。

表2 组合物治疗试验设计Tab.2 Composition treatment trial groups

2 结果与分析

2.1 中药有效成分对O78大肠杆菌的MIC（见图1）

图1 中药有效成分对O78大肠杆菌的MICFig.1 MIC of active components of traditional Chinese medicine against Escherichia coli O78

由图1可知，小檗碱、柠檬酸、芦丁对大肠杆菌的MIC为2.00、6.25、8.00 g/L，小檗碱的抑菌效果最好。DMSO作为溶剂对照组对大肠杆菌MIC为25%，而本试验中DMSO作为溶剂所用浓度为10%，因此对本试验结果无影响。

2.2 大肠杆菌最佳攻毒剂量确定（见表3）

表3 大肠杆菌最佳攻毒剂量确定Tab.3 Determination of optimal Challenge dose of E. coli 单位:只

由表3 可知，根据改良寇氏法得出大肠杆菌O78 对蛋雏鸡LD50=1.102×108CFU/mL。即1.102×108CFU/mL、0.5 mL为最佳的攻毒剂量。

2.3 动物回归试验（见图2、表4）

图2 动物回归试验结果Fig.2 Result of animal regression test

表4 大肠杆菌生化试验结果Tab.4 Biochemical reactions of E. coli

由图2可知，患病蛋雏鸡剖检可见心脏、肝脏表面有黄色纤维素性渗出物，包膜肥厚易剥离，与周围组织粘连。将上述病料无菌接种于麦康凯琼脂平板，37 ℃培养24 h，形成中等大小、突起的粉红色菌落；挑取病料显微镜观察下可见粉红色的革兰氏阴性短杆菌。

由表4可知，生化反应试验结果显示，分离株与大肠杆菌接近度为99.8%。测序后经序列比对同源性在99.9%以上，表明分离株为大肠杆菌。玻片凝集试验出现明显凝集现象，说明分离株与攻毒菌株为同一菌株，大肠杆菌致病模型建立成功。

2.4 中药组合物治疗鸡大肠杆菌病的效果（见表5）

表5 中药组合物治疗鸡大肠杆菌病的效果Tab.5 Clinical therapeutic effect of the composition on chicken colibacillosis

由表5 可知，中药组合物与头孢噻肟联合使用可增强头孢噻肟对大肠杆菌的治疗作用，且优于头孢噻肟单独治疗效果。阳性对照组鸡群治愈率为60.0%、有效率为72.0%、死亡率为16.7%；试验组鸡群治愈率达86.7%、有效率为93.3%、死亡率仅为6.7%。综上所述，组合物与头孢噻肟联合应用可增强头孢噻肟对大肠杆菌的治疗作用。

3 讨论

随着养殖业的快速发展，采用集约化养殖的鸡场养殖数量不断扩大，饲养密度持续增大，易发多种疾病。鸡大肠杆菌病作为规模化鸡场常发疾病之一，严重危害鸡的生长发育[8]。禽大肠杆菌病常与血清型为O1、O2、O5、O8、O18和O78等大肠杆菌相关[9]。鸡群各个年龄段均易感大肠杆菌病，其中成年鸡群感染率最高（36.73%）。鸡大肠杆菌病治疗多依赖抗生素，但随着多重耐药大肠杆菌分离株增多，导致抗生素对这类疾病的治疗效果不佳。APEC 菌株可表达对超广谱β-内酰胺类抗生素耐药的基因，从而降低头孢噻肟的药效，因此头孢噻肟在家禽养殖和孵化场的应用有限[10]。治疗鸡大肠杆菌病方式有多种，如抗生素、噬菌体、中药等，但使用抗生素时，虽然可辅助宿主防御、控制和消除感染，但也可引起毒性或过敏反应，并与耐药菌发生重叠感染，促进微生物染色体突变产生耐药性，随后耐药基因向易感物种转移，进一步促进耐药基因的表达[5]。而我国传统中药治疗细菌感染时不易产生耐药性，对机体的毒性作用较小，且组方中药具有多靶点优势[4,11]，根据不同耐药机制筛选中药进行组方治疗，可降低大肠杆菌耐药性，提高鸡大肠杆菌病治愈率[7]。贺常亮等[12]表明，用香芪汤组方治疗经大肠杆菌O78攻毒鸡群，高剂量组对患病鸡群的有效率（86.7%）显著高于中剂量组（80%）和低剂量组（60%）；并且高剂量组心包炎和肝周炎发病率分别为66.7%和40.0%，显著低于攻毒对照组、低剂量组。于文会等[13]表明，黄连组方对大肠杆菌O78 具有抑制作用，其MIC 为62.5 g/L、菌株死亡率为74.1%，显著高于正常组菌株死亡率（37.2%）；中剂量组对发病雏鸡治疗效果显著，治愈率为86.67%，明显高于西药组（治愈率60%）。曹翠萍[14]研究表明，黄芩+阿米卡星组方对患有鸡大肠杆菌病的鸡群治愈率（76.6%）和保护率（83.3%），均高于阿米卡星对照组（治愈率43.3%、保护率53.3%）和感染对照组（治愈率3.3%、保护率16.7%）。申海龙[15]研究表明，采用中药、西药、中西药组合治疗某鸡场发病鸡，中药组治愈率50%，西药组治愈率60%，中西药组合组治愈率80%，中西药联合使用可以有效增加疾病治愈率。上述研究结果表明，中药组方治疗鸡大肠杆菌病具有较好的效果，且中西药联合应用可提高疾病治愈率，但目前对中药有效成分和头孢噻肟联用治疗禽大肠杆菌病的报道较少，本研究利用中药有效成分组合物与头孢噻肟联合治疗禽大肠杆菌病，避免了中药的缺点，同时还继承了其多靶点的优点，比传统中药的治疗效果更佳。

4 结论

本试验结果显示，由柠檬酸、芦丁、小檗碱组成的中药组合物和头孢噻肟联合应用治疗禽大肠杆菌病的有效率高达93.3%，高于传统组方三黄汤治疗组（80.0%），表明该组合物可应用于治疗禽大肠杆菌病。中药药效因多种因素影响导致临床应用受到限制，中药有效成分组合物具有多靶点、不易产生耐药性的优点，更便于临床上推广应用，并且与头孢噻肟联用对禽大肠杆菌病的有效率高达93.3%，为临床中大肠杆菌病的治疗及用药提供新思路。