阿托伐他汀预处理对缺氧复氧后乳鼠心肌细胞的保护作用及其机制

刘会，谭洪文，庞军，张曙影

1 贵州省人民医院心内科，贵阳 550002；2 大连大学附属中山医院心内科

近年来，急性心肌梗死的发病率及病死率呈逐年上升趋势［1］。再灌注治疗是急性心肌梗死最有效的治疗手段，但再灌注可能会进一步加重心肌结构损伤及功能障碍，削弱再灌注治疗的临床效果。缺血再灌注时细胞内线粒体ATP敏感的钾通道（mito-KATPC）关闭，线粒体膜通透性转换孔（MPTP）开放，导致细胞凋亡及坏死［2-4］。研究显示，急诊再灌注治疗前给予负荷剂量的阿托伐他汀可降低血清心肌坏死标志物水平，提示阿托伐他汀可减轻缺血再灌注损伤［5］。缺氧复氧模型是体外细胞水平研究缺血再灌溉损伤的理想模型，但目前关于阿托伐他汀减轻缺血再灌注损伤的具体机制是否与mitoKATPC和MPTP有关尚未可知。2020年3月—2022年2月，本研究观察了阿托伐他汀预处理对缺氧复氧后乳鼠心肌细胞的保护作用，并探讨其机制是否与mitoKATPC和MPTP有关。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 实验动物：SPF级新生C57BL/6乳鼠50只，出生3 d内，体质量9～13 g，由北京维通利华实验动物有限公司提供，动物合格证书编号：SCXK（京）2006-009。主要试剂：DMEM-H培养基、高糖DMEM培养基、无糖DMEM培养基、胎牛血清均购自美国Gibco公司，胰蛋白酶、青—链霉素溶液、钙离子荧光探针（Fluo-3 AM）检测试剂盒、MPTP检测试剂盒、活性氧（ROS）检测试剂盒均购自中国碧云天生物科技有限公司，小鼠来源α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）一抗、辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗小鼠二抗均购自美国Abcam公司，阿托伐他汀购自美国辉瑞制药有限公司，mitoKATPC通道阻断剂5-羟基葵酸、CCK-8试剂盒均购自美国Sigma公司，MPTP开放剂氯尼达明购自中国Aladdin生物科技有限公司，JC-1线粒体膜电位检测试剂盒购自中国Beyotime生物科技有限公司。

1.2 乳鼠心肌细胞获取与原代培养 取新生C57BL/6小鼠50只，采用颈椎脱臼法处死，置于75%乙醇中浸泡消毒，开胸后取出心脏；留取心尖部位，快速置于预冷的PBS溶液漂洗3次，剔除周围结缔组织，置于无菌平皿中。尽量将心尖组织剪碎，加入适量0.125%胰酶，在37 ℃培养箱中，采用分次消化的方法消化8～10次，每次消化5 min，消化后取上清液。在上清液中加入等量含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基，轻轻混匀。用200目细胞过滤筛过滤含细胞的混合液，取过滤后的细胞悬液，1 000 r/min离心5 min，收集沉淀，用含15%胎牛血清+1%青—链霉素的DMEM-H培养基进行重悬，调整细胞密度为2×105/mL。将细胞接种于细胞培养瓶中，在培养箱（37 ℃、5% CO2、95% O2）中培养90 min左右，将未贴壁的细胞悬液吸出，放入新的培养瓶中（加入0.1 mmol/mL BrdU以阻止成纤维细胞增殖）继续培养。

1.3 乳鼠心肌细胞鉴定 ①乳鼠心肌细胞形态观察：取“1.2”培养瓶中的乳鼠心肌细胞，显微镜下观察心肌细胞生长形态及生长状况。结果显示，培养24 h后可见单个细胞的自发收缩，继而逐渐铺展伸出伪足，形成不规则的星形（OSID码图1A）；培养4 d，细胞相互接触交织成网，形成细胞单层或细胞簇，收缩搏动规律有力（OSID码图1B）。②乳鼠心肌细胞α-SMA表达：采用免疫组化法。将“1.2”原代分离的心肌细胞接种于细胞爬片上，在培养箱（37 ℃、5% CO2、95% O2）中培养6 h，PBS漂洗2 min ×2次，4%多聚甲醛室温下固定20 min，PBS漂洗2 min×2次；0.5% Triton X-100室温下穿膜20 min，PBS漂洗2 min×3次，3% H2O2室温下处理15 min，PBS漂洗后加入山羊血清室温封闭60 min，加入小鼠来源的α-SMA一抗（稀释比例1∶100），4 ℃孵育过夜，次日PBS漂洗5 min×3次；加入HRP标记的山羊抗小鼠二抗（稀释比例1∶50），37 ℃孵育30 min，PBS漂洗5 min×3次；避光情况下加入DAB显色1～10 min，蒸馏水漂洗5 min×2次，苏木素复染5 min，自来水洗返蓝，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。显微镜下观察显示，心肌细胞α-SMA抗原表达呈阳性，细胞质被染成棕黄色（OSID码图2）。证实“1.2”分离培养的细胞为心肌细胞。

1.4 细胞分组与阿托伐他汀干预处理 将“1.3”鉴定后的乳鼠心肌细胞随机分为五组，即control组、H/R组、Ator组、5-HD+Ator组和LND+Ator组。control组加入含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基，在常规培养箱（37 ℃、5% CO2、95% O2）中培养。其余各组吸去细胞培养液后进行缺氧复氧处理，即更换为95%N2+5% CO2混合气体饱和的无糖DMEM培养基，置于缺氧罐中（95%N2+5% CO2混合气体饱和，37 ℃、O2＜1%）；缺氧培养12 h，取出培养板，更换高糖DMEM培养液，放回5% CO2培养箱（95%空气+5%CO2）中继续培养6 h。Ator组缺氧复氧前给予1 µmol/L阿托伐他汀预处理3 h；5-HD+Ator组缺氧复氧前给予100 µmol/L 5-羟基葵酸干预20 min，洗掉5-羟基葵酸后，给予1 µmol/L阿托伐他汀干预3 h；LND+Ator组缺氧复氧前给予1 µmol/L阿托伐他汀干预3 h、30 µmol/L 氯尼达明干预20 min，再洗掉氯尼达明。

1.5 心肌细胞存活能力观察 采用CCK-8法。取心肌细胞制备细胞悬液，调整细胞密度为1×105/mL，分别接种于96孔板中，每孔100 µL，每组设3个复孔。将96孔板移入37 ℃、5% CO2培养箱中培养3 h，按照1.4进行分组处理，每孔加入CCK-8溶液10 µL，培养箱内孵育1～4 h，严格按照CCK-8试剂盒说明书操作。使用酶标仪在450 nm波长下测定各组细胞的光密度（OD）值，同时设置空白孔、对照孔，计算细胞存活率。

1.6 细胞内钙离子浓度检测 采用流式细胞术。取分组处理后的各组细胞，去除培养液，PBS漂洗3次，加入终浓度为5 µmol/L的Fluo-3 AM工作液，溶液量以能充分覆盖细胞为准，在37 ℃条件下避光孵育40 min，进行荧光探针装载。PBS漂洗细胞3次，使用PBS重悬细胞，制成密度为1×105/mL的细胞悬液，37 ℃避光孵育20 min。上流式细胞仪检测各组细胞内Fluo-3荧光强度，Fluo-3荧光强度越大提示细胞内钙离子浓度越大。激发波长为488 nm，发射波长为525 nm。

1.7 细胞内线粒体膜电位测定 采用流式细胞术。取分组处理后的各组细胞，加入胰酶消化，离心后弃上清，加入0.5 mL 含血清和酚红的细胞培养液重悬，加入0.5 mL JC-1 染色工作液，颠倒数次混匀，细胞培养箱中37 ℃孵育20 min。离心后弃上清，加入1 mL JC-1 染色缓冲液重悬细胞，上流式细胞仪检测红绿荧光强度，计算红绿荧光强度百分比，该值下降表示线粒体膜电位下降。检测 JC-1 单体时，激发波长为490 nm、发射波长为530 nm；检测JC-1 聚合物时，激发波长为525 nm、发射波长为590 nm。

1.8 细胞MPTP开放情况观察 采用流式细胞术。取分组处理后的各组细胞，制成细胞悬液，离心后弃上清，PBS漂洗2次，离心后收集细胞沉淀。按照试剂盒说明书配制钙黄绿素乙酰氧基甲酯（Calcein AM）染色液及荧光淬灭工作液。在各组细胞沉淀中加入200 µL荧光淬灭工作液，颠倒数次混匀，37 ℃细胞培养箱中孵育30 min，离心5 min后弃上清；加入200 µL Calcein AM染色液进行重悬，上流式细胞仪分析绿色荧光强度，以此表示心肌细胞MPTP开放情况；绿色荧光强度越大提示MPTP开放程度越低。使用仅含检测缓冲液的细胞样品用于阴性对照设置，Calcein AM的激发波长为494 nm、发射波长为517 nm。

1.9 细胞ROS含量检测 采用流式细胞术。取分组处理后的各组细胞，制成细胞悬液，转移到15 mL离心管中，离心后弃上清，加入DMEM培养基，并用移液管将细胞吹打均匀，配制成密度为5×104/mL的细胞悬液。将细胞悬液接种到6孔板，每孔2.5 mL，37 ℃、5% CO2培养箱中培养6 h。收集细胞后PBS漂洗2次，离心后收集细胞沉淀。每管加入终浓度为10 µmol/L的荧光探针2，7-二氯荧光黄双乙酸盐（DCFH-DA）100 µL，37 ℃条件下孵育60 min，DMEM培养基漂洗3次，上流式细胞仪检测细胞ROS含量，激发波长为485 nm、发射波长为525 nm。1.10 统计学方法 采用SPSS17.0统计软件。计量资料采用S-W正态性检验，呈正态分布以表示，多组间比较采用方差分析，两组间比较采用t检验，重复测量数据采用重复测量的方差分析；非正态分布以M（P25，P75）表示，组间比较采用秩和检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

与control组比较，H/R组、Ator组、5-HD+Ator组、LND+Ator组细胞存活率均降低、钙离子浓度均升高，H/R组、5-HD+Ator组、LND+Ator组线粒体膜电位均降低、MPTP开放程度及ROS含量均升高（P均＜0.05）。与H/R组、5-HD+Ator组、LND+Ator组比较，Ator组细胞存活率、线粒体膜电位均升高，钙离子浓度、MPTP开放程度及ROS含量均降低（P均＜0.05）。见表1及OSID码图3～6。

表1 各组细胞存活率、钙离子浓度、线粒体膜电位、MPTP开放情况及ROS含量比较（）

表1 各组细胞存活率、钙离子浓度、线粒体膜电位、MPTP开放情况及ROS含量比较（）

注：与control组比较，*P＜0.05；与H/R组比较，#P＜0.05；与Ator组比较，△P＜0.05。

组别细胞存活率（%）control组H/R组Ator组5-HD+Ator组LND+Ator组ROS（平均荧光强度）23 245.2 ± 82.5 29 861.3 ± 168.5*26 315.2 ± 359.9#33 350.2 ± 520.5*△35 255.9 ± 778.7*△100.0 ± 0.2 23.7 ± 1.5*32.4 ± 1.3*#23.8 ± 1.8*△28.8 ± 1.3*△钙离子浓度（Fluo-3荧光强度）18 132.2 ± 1 047.2 33 362.1 ± 1 145.4*27 188.8 ± 1 034.2*#42 671.6 ± 1 124.5*△33 325.4 ± 1 043.8*△线粒体膜电位（红绿荧光强度百分比，%）73.5 ± 0.8 59.5 ± 1.3*66.8 ± 1.4#58.1 ± 1.2*△59.5 ± 1.1*△MPTP开放情况（绿色荧光强度）147 397.4 ± 1 323.9 85 620.4 ± 1 087.8*128 700.5 ± 1 135.4#87 127.1 ± 1 072.8*△94 836.3 ± 1 132.4*△

3 讨论

在心肌梗死及再灌注初期，心肌细胞发生坏死、凋亡，导致心肌细胞数量锐减，非梗死区心肌细胞间质纤维化，心肌收缩力下降，从而引起心功能不全。再灌注治疗可缩小心肌梗死面积，保护心肌组织，但再灌注也有可能会进一步加重心肌结构及功能障碍，削弱再灌注治疗的效果。因此，防止缺血再灌注损伤意义重大。研究表明，阿托伐他汀能够明显增强细胞抗氧化酶活性，抑制脂质过氧化，可减少缺血再灌注损伤诱导的心肌细胞凋亡，从而减轻再灌注造成的损伤，具有较好的心肌保护作用［4］。本研究建立心肌细胞缺氧复氧模型，发现心肌细胞进行缺氧复氧处理后的细胞存活率降低，应用阿托伐他汀预处理后的细胞存活率升高，这提示阿托伐他汀预处理可减轻心肌细胞的缺氧复氧损伤；而加入mito-KATPC 阻断剂5-羟基葵酸及MPTP开放剂氯尼达明进行干预后，阿托伐他汀的心肌保护作用被减弱，这也提示阿托伐他汀预处理减轻心肌细胞缺氧复氧损伤的机制可能与mitoKATPC和MPTP有关。

线粒体膜电位的变化与心肌缺血再灌注损伤有着密切的关系，线粒体膜电位下降是细胞凋亡早期的一个标志性事件。当细胞受到凋亡诱导后，线粒体膜电位变化使得膜的通透性发生改变［2-3］。在心肌缺血再灌注损伤过程中，线粒体mitoKATPC关闭，MPTP持续开放，导致线粒体肿胀、线粒体膜电位去极化、线粒体膜电位下降、ATP合成受阻及线粒体膜损伤，线粒体内ROS经由开放的MPTP大量进入细胞质，激活和释放各种凋亡蛋白，导致心肌细胞内钙离子增加，形成钙超载，迅速引起心肌细胞死亡［5-6］。线粒体mitoKATPC的激活会造成钾离子内流，导致膜电位去极化，抑制细胞内的钙离子向线粒体内流，防止线粒体内钙超载，同时有助于维持适宜的线粒体体积和能量代谢、调节自由基生成、减少细胞凋亡，最终减轻心肌缺血再灌注损伤［7］。国内外研究表明，开放mitoKATPC和抑制MPTP开放可引起线粒体膜电位下降，减少线粒体肿胀、钙超载和ROS生成，从而保护再灌注心肌［8-9］。mitoKATPC开放剂二氮嗪可效仿缺血预处理（IPC）的心肌保护效应［10］，而选择性的mitoKATPC阻断剂5-羟基葵酸和MPTP开放剂苍术苷则会减弱IPC的心肌保护效应［11］。IPC通过多种信号途径促进细胞内mitoKATPC开放、关闭MPTP，从而减少细胞损伤、凋亡，是目前惟一有效防止缺血再灌注损伤的方法［12-13］。因此，mitoKATPC-MPTP轴被认为是防治心肌缺血再灌注损伤的重要通路。研究表明，p38 丝裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）是mito-KATPC的上游调控因子，可促使mitoKATPC开放，从而保护心肌［14］。也有研究发现，辛伐他汀通过激活mitoKATPC而减轻缺血再灌注损伤，从而减少无复流［15］。

Fluo-3 AM是一种可以穿透细胞膜的荧光染料，Fluo-3 AM的荧光非常弱，其荧光不会随钙离子浓度升高而增强。Fluo-3 AM进入细胞后可以被细胞内的酯酶剪切形成Fluo-3，从而被滞留在细胞内。Fluo-3可以和钙离子结合，结合钙离子后可以产生较强的荧光。因此，Fluo-3 AM被广泛用于检测细胞内钙离子浓度。在正常线粒体内，JC-1聚集在线粒体基质中形成聚合物，聚合物发出强烈的红色荧光；不健康的线粒体由于膜电位下降或丧失，JC-1只能以单体的形式存在于细胞质中，产生绿色荧光；因此，常用红绿荧光强度百分比来衡量线粒体膜电位是否下降，线粒体膜电位下降时红绿荧光强度百分比下降。JC-1 是一种广泛用于检测线粒体膜电位的理想荧光探针。因此，我们使用Fluo-3 AM检测钙离子浓度，使用JC-1检测细胞内线粒体膜电位。本研究对细胞进行缺氧复氧处理后，心肌细胞内钙离子浓度、ROS含量、MPTP开放情况增加，线粒体膜电位下降；应用阿托伐他汀预处理后，心肌细胞内钙离子浓度、ROS含量、MPTP开放程度有所下降，线粒体膜电位升高；而应用mitoKATPC阻断剂5-羟基葵酸及MPTP开放剂氯尼达明进行干预后，心肌细胞内钙离子浓度、ROS含量、MPTP开放程度增加，线粒体膜电位下降；以上结果提示，阿托伐他汀可通过开放mitoKATPC及关闭MPTP逆转心肌细胞缺氧复氧损伤。

综上所述，阿托伐他汀可通过开放mitoKATPC和关闭MPTP而减轻乳鼠心肌细胞的缺氧复氧损伤，阿托伐他汀的这一心肌保护作用可被mitoKATPC阻断剂5-羟基葵酸及MPTP开放剂氯尼达明逆转。但阿托伐他汀是否通过别的信号通路减轻心肌细胞缺氧复氧损伤尚未可知，未来需进一步研究。