LncRNA NNT-AS1通过miR-582-5p/MCL1对肝癌细胞侵袭和转移的影响*

孙波, 周雷, 周东亚, 王小龙, 徐超, 吕莹, 刘犇

(南京中医药大学沭阳附属医院 肿瘤科, 江苏 宿迁 223600)

肝癌是全球最常见的癌症死亡原因之一,也是中国第4大最常见的癌症死亡原因[1-2]。肝癌的预后很差,即使经过手术切除和标准化治疗,其复发率和转移率仍然很高[3-4]。因此,深入研究肝癌防治的新靶点,对提高肝癌的早期诊断和临床预后具有重要意义。长非编码RNA(lncRNA)是一类非蛋白质编码RNA转录物,长度超过200个核苷酸,被认为是癌症生物学中的新型调控因子[5]。异常表达的lncRNA通过转录或转录后基因调控影响癌细胞的增殖、转移、自我更新和凋亡,促进多种癌症类型的发生发展[6]。有证据表明lncRNA可能是癌症检测的有效生物标志物,包括肝癌在内的多种癌症类型的致瘤性都涉及各种lncRNA[7-8]。其中,LncRNA NNT-AS1是一种新鉴定的lncRNA,位于3个外显子的5p12处,被认为是肝癌致癌基因[9]。NNT-AS1在肝癌发展中的机制研究极为匮乏。lncRNA通过降低其靶miRNA的水平在人类肿瘤中发挥作用已被广泛接受。据报道,NNT-AS1通过抑制miR-22-3p增强肺癌细胞的增殖、迁移和侵袭[10]。此外,lncRNA牛磺酸上调基因1通过海绵miR-582-5p促进肝癌进展[11]。有研究表明,miR-582-5p在肝癌中表达降低[12],NNT-AS1是否通过调控miR-582-5p来影响肝癌进展仍不明确。MCL1是抗凋亡BCL-2家族蛋白的关键成员,MCL1的独特之处在于其有效的泛素化和破坏作用,并且具有促进肿瘤侵袭和转移的功能[13]。目前MCL1在肝癌进展中的作用机制还不明确,是否由LncRNA/miRNA介导和调节也不清楚。因此本研究旨在探讨NNT-AS1、miR-582-5p和MCL1对肝癌细胞侵袭和转移的影响。

1 材料与方法

1.1 细胞培养

选择正常肝细胞L-02细胞和肝癌细胞MHCC97H、LM3、SMCC7721、Huh7、Hep3B(购于ATCC,中国)进行培养。置于37 ℃、5%CO2细胞培养箱(型号thromo3111,美国)中,用含10% 胎牛血清(Gibco,美国)的RPMI1640培养基(Gibco,美国)培养,每天更换培养基,3～4 d传代。选择处于对数生长期并且生长状态较好的细胞进行实验。

1.2 细胞分组及转染

取对数期生长的人肝癌Huh7细胞系 按1×105/孔密度接种于6孔培养板内,转染前1 d用不含血清和双抗的RPMI 1640培养基培养将细胞分组并转染:Control组(不做处理细胞)、si-NC组、si-NNT-AS1组、NC mimics组、miR-582-5p mimics组、si-NC+NC mimic、si-NNT-AS1+NC mimics、si-NC+miR-582-5p mimics组、si-NNT-AS1+miR-582-5p mimics组、si-NNT-AS1+oe-NC及si-NNT-AS1+oe-MCL1组,按照Lipofectamine 2000说明书进行转染,将50 ng si-NNT-AS1、miR-582-5p mimics、oe-NC或NC(上海吉玛公司,中国)快速离心,与170 μL磷酸盐缓冲液(赛默飞世尔,USA)混匀后,静置5 min,加入Lipofectamine 2000 8 μL(thromo,美国),轻微震荡充分混匀后,室温下静置20 min,5 μmoL/L DAPT添加后加入到6孔板中,轻轻混匀,8 h换为含10%胎牛血清的培养基(Gibco,美国)。转染48 h后,收集细胞用于后续实验。

1.3 观察指标

1.3.1qRT-PCR检测NNT-AS1、miR-582-5p、MCL1表达水平 收集转染48 h后的各组细胞,Trizol(货号16096020,赛默飞世尔科技,纽约,美国;货号B1802,哈尔滨新海基因检测有限公司,中国)提取总RNA。TaqMan MicroRNA Assays Reverse Transcription Primer(Thermo scientific公司, USA)逆转录合成cDNA。SYBR®Premix Ex TaqTMⅡ试剂盒(行知生物科技有限公司,中国)进行荧光定量PCR检测。依次加入以下组分: SYBR®Premix Ex TaqTMⅡ(2×)25 μL, PCR上、下游引物各2 μL,ROX Reference Dye(50×)l μL, DNA模板4 μL, ddH2O16 μL。在ABI PRISM®7300(型号Prism®7300,上海坤科仪器设备有限公司,中国)系统进行荧光定量PCR。反应条件:95 ℃预变性10 min,95 ℃变性15 s,60 ℃退火30 s,循环32次后72 ℃延伸1 min。ΔCt = CT(目的基因)-CT(GAPDH),ΔΔCt=ΔCt(实验组)-ΔCt(对照组),基因以U6为内参,用2-ΔΔCt表示各目的基因相对表达量。引物见表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.3.2Western blot检测 MCL1蛋白表达 细胞转染培养48 h后,预冷的PBS洗3遍,使用含PMSF的RIPA裂解液(R0010,solarbio)提取细胞中总蛋白。BCA试剂盒(thromo,美国)测定蛋白浓度,去离子水调零。样品与上样缓冲液混合,100 ℃金属浴煮10 min,点样时加入50 μg蛋白样品,以70 V恒压电泳3 h。湿转法将蛋白转移至PVDF膜(ISEQ00010,Millipore,Billerica,MA,USA)上,恒流150 mA转膜。5%脱脂奶粉4 ℃室温封闭2 h;弃去牛奶,TBST洗去牛奶,用一抗兔抗人MCL1(ab32087,1∶2 000)、GAPDH(ab8226,1∶2 000,Abcam,UK)4 ℃孵育过夜,TBST洗3次,每次6 min。HRP 标记的羊抗兔IgG抗体(北京中山生物技术有限公司,1∶5 000稀释)孵育2 h。TBST洗3次、每次6 min,洗后泡在TBS中。取ECL荧光检测试剂盒(货号BB-3501,Ameshame公司,英国)中A液和B液,等体积混匀,200 μL滴加在膜上,在凝胶成像仪中曝光成像。用Bio-Rad图象分析系统(美国BIO-RAD公司)照相,用Image J软件分析,以相应蛋白条带的灰度值/GAPDH蛋白条带的灰度值表示相对蛋白含量。

1.3.3RIP检测NNT-AS1和miR-582-5p结合 采用RIP试剂盒(millipore,USA)检测NNT-AS1和miR-582-5p结合情况。用预冷PBS洗神经元后弃上清。用等体积的RIPA裂解液(P0013B,碧云天)冰浴5 min裂解细胞,14 000 r/min,4 ℃离心10 min取上清。细胞提取液一部分取出作为input,一部分与抗体孵育进行共沉淀。具体步骤:每一个共沉淀反应体系取50 μL磁珠清洗后重悬于 RIP Wash Buffer100 μL中,依据实验分组加入5 μg抗体孵育以便结合。磁珠-抗体复合物经清洗后与重悬于RIP Wash Buffer900 μL ,加入100 μL细胞提取液4 ℃孵育过夜。样品置于磁座上收集磁珠-蛋白复合物。样品及Input分别经蛋白酶K消化后提取RNA,PCR检测NNT-AS1和miR-582-5p结合。RIP所用抗体为:AGO2(ab32381,1∶1 000,Abcam,UK),室温混匀30 min,IgG(1∶100,ab109489)作为阴性对照。

1.3.4生物信息学网站和双荧光素酶报告基因实验 首先经过生物学预测网站(www.targetscan.org)进行miR-582-5p与MCL1结合位点的分析。接下来通过双荧光素酶报告系统验证miR-582-5p与MCL1的靶向关系。构建靶基因MCL1双荧光素酶报告基因载体与miR-582-5p结合位点突变的突变体:MCL1wt和MCL1mut。将Rellina质粒和两种报告质粒分别与miR-582-5p mimics和NC mimics质粒共转染到HEK293T细胞中。将Rellina质粒和两种报告质粒分别与miR-582-5p mimics质粒和NC mimics质粒共转染到HEK293T细胞中,在细胞转染24 h后,进行双荧光素酶检测。首先将各组细胞裂解,裂解后以12 000 g离心1 min,去沉淀,收集上清液。双荧光素酶报告试剂盒购自Promega,按照试剂盒操作,测量荧光素酶活性。操作步骤如下:将裂解后的细胞样品吸入EP管中,每10 μL样品中萤火虫荧光素酶工作溶液100 μL,测得萤火虫荧光素酶之后加入海肾荧光素酶工作溶液100 μL,测得海肾荧光素酶结果。相对荧光素酶活性=萤火虫荧光素酶/海肾荧光素酶。

1.3.5Transwell检测细胞迁移和侵袭能力 采用trans-well培养系统检测细胞的迁移和侵袭能力。使用涂有Matrigel(BD Biosciences Discovery Labware,Woburn,MA,USA)的上腔室的透孔膜;在37 ℃的培养箱中,用无血清培养基将小室再水化2 h。随后将顶部室用200 uL细胞悬浮液(含有1×105个细胞)水合。在底部室中加入500 uL含有10%FBS作为化学吸引剂的培养基。在37 ℃下培养24 h后,将膜下表面的跨膜细胞在室温下用甲醛固定5 min,用结晶紫染色20 min,用清水洗涤3次,并在显微镜下计数。

1.4 统计学分析

2 结果

2.1 肝癌细胞系中NNT-AS1和miR-582-5p表达

qRT-PCR结果显示,与肝细胞L-02比较,MHCC97H、LM3、SMCC7721、Huh7、Hep3B细胞中NNT-AS1表达升高,miR-582-5p表达降低,差异有统计学意义(P<0.05);其中Huh7细胞中NNT-AS1表达量最高,选择该细胞进行后续实验。见图1。

注：(1)与肝细胞L-02比较,P<0.05。

2.2 沉默NNT-AS1和过表达miR-582-5p对肝癌细胞株Huh7侵袭和转移的影响

为探究NNT-AS1对肝癌细胞株Huh7侵袭和转移的影响,分别对Huh7细胞进行NNT-AS1和miR-582-5p沉默和过表达处理,并通过transwell检测各组细胞的侵袭和转移情况。结果显示,与si-NC组比较,si-NNT-AS1组细胞侵袭和转移能力显著降低,差异有统计学意义(P<0.05);与NC mimics组比较,miR-582-5p mimics组细胞侵袭和转移能力显著降低,差异有统计学意义(P<0.05)。见图2。

注：A为transwell转移与侵袭图(结晶紫染色,×200),B为各组细胞转移细胞数量统计分析,C为各组细胞侵袭细胞数量统计分析;(1)与si-NC组比较,P<0.05;(2)与NC mimics组比较,P<0.05。

2.3 NNT-AS1对海绵miR-582-5p的吸附情况

通过生信筛选发现LncRNA NNT-AS1和miR-582-5p存在结合位点。为探究NNT-AS1和miR-582-5p之间的关系,RIP实验验证NNT-AS1与miR-183-5p的结合能力(图3);与IgG(1.00±0.04)比较,AGO2(1.54±0.06)结合的miR-183-5p的量显著增多,差异有统计学意义(P<0.05),提示NNT-AS1可海绵吸附miR-582-5p。

注：A为transwell转移与侵袭图(结晶紫染色,×200),B为各组细胞转移细胞数量统计分析,C为各组细胞侵袭细胞数量统计分析;(1)与si-NC+NC mimic组比较,P<0.05;(2)与si-NNT-AS1+NC mimics组比较,P<0.05。

2.4 NNT-AS1吸附miR-582-5p在肝癌细胞株Huh7侵袭和转移的影响

transwell检测各组肝癌细胞株Huh7的侵袭和转移情况,结果显示,与si-NC+NC mimic比较,si-NNT-AS1+NC mimics组Huh7细胞侵袭和转移能力显著减弱,si-NC+miR-582-5p mimics组Huh7细胞侵袭和转移能力显著降低,差异有统计学意义(P<0.05);与si-NNT-AS1+NC mimics比较,si-NNT-AS1+miR-582-5p mimics组Huh7细胞侵袭和转移能力显著降低,差异有统计学意义(P<0.05)。见图3。

2.5 miR-582-5p靶向结合MCL1

生信网站分析发现miR-582-5p与 MCL1存在结合位点。双荧光素酶报告检测发现,miR-582-5p与突变的MCL1的3′-UTR共转染后差异无统计学意义(P>0.05),而miR-582-5p与野生型的MCL1的3′-UTR共转染后萤光素酶活性明显降低,差异有统计学意义(P<0.05)。见图4。结果提示,MCL1是miR-582-5p的下游靶基因。

注：(1)与NC mimics组比较,P<0.05。

2.6 miR-582-5p对MCL1表达的影响

qRT-PCR结果显示,与NC mimics(1.00±0.05)组比较,miR-582-5p mimics(0.24±0.03)组Huh7细胞中MCL1表达明显下调,差异有统计学意义(P<0.05)。

2.7 肝癌细胞系中MCL1表达

Western blot结果显示,与肝细胞L-02比较,MHCC97H、LM3、SMCC7721、Huh7、Hep3B细胞MCL1表达明显升高,差异有统计学意义(P<0.05)。见图5。

注：A为各组细胞MCL1的蛋白条带图,B为各组细胞MCL1的蛋白水平统计图;(1)与肝细胞细胞L-02比较,P<0.05。

2.8 NNT-AS1/MCL1在肝癌细胞的侵袭与转移中的作用

将肝癌细胞株Huh7中NNT-AS1沉默后,再将MCL-1过表达,采用transwell检测沉默MCL1后细胞的侵袭和转移情况。结果显示,与si-NNT-AS1+oe-NC组比较,si-NNT-AS1+oe-MCL1组Huh7细胞侵袭和转移能力显著增强,差异有统计学意义(P<0.05)。见图6。提示MCL-1能够恢复NNT-AS1沉默对肝癌细胞的侵袭和转移能力的抑制。

注：A为transwell转移与侵袭图(结晶紫染色,×200),B为各组细胞转移细胞数量统计分析,C为各组细胞侵袭细胞数量统计分析;(1)与si-NNT-AS1+oe-NC组比较,P<0.05。

3 讨论

肝癌细胞具有很强的转移能力,并且在早期阶段患者是没有明显症状的,一般发现时已有伴有淋巴结远处转移[14-15]。而肝癌的致病原因难以追踪,因而探究肝癌发生进程中的分子机制以及研发出具有广谱性的分子靶点和治疗药物是目前亟待解决的问题。随着高通量RNA测序和生物信息学分析的发展,已经报道了许多新发现的lncRNA在多种肿瘤发生过程中起癌基因或抑癌作用。例如,lncRNA SNHG1在肝癌组织和细胞系中显着上调,并通过抑制miR-195促进肝癌细胞增殖,侵袭和迁移[16]。LincRNA-p21在肝癌组织和细胞中被下调,而lincRNA-p21的表达增强可以抑制Notch信号和上皮-间质转化[17]。miRNA是细胞正常发育过程中决定细胞命运的重要因素[18-19],MCL-1是一种独特的抗凋亡Bcl2家族蛋白,在控制癌细胞凋亡和生存方面起着看门人的作用,目前已在多种癌症中观察到MCL-1受体及其配体在肿瘤细胞中异常高表达[20]。目前多个报道证实,LncRNA NNT-AS1在癌症中异常高表达,且通过吸附miRNA,调节下游靶基因的表达,对肿瘤细胞生命活动发挥其影响。本研究选择正常肝细胞L-02细胞和肝癌细胞株MHCC97H、LM3、SMCC7721、Huh7、Hep3B,检测NNT-AS1在正常细胞和5种肝癌细胞中的表达,发现NNT-AS1在五种癌细胞中较正常细胞表达明显较高。根据文献调研和生信分析,NNT-AS1可结合并吸附miR-582-5p,通过实验发现,miR-582-5p在5种癌细胞中较正常细胞表达明显较低,随后干扰NNT-AS1并且过表达miR-582-5p发现肝癌细胞Huh7的侵袭和转移能力明显被抑制,且同时作用时,抑制作用更强。为进一步探讨miR-582-5p下游的调控机制,通过生信预测到MCL-1是miR-582-5p的下游靶基因,并且从多个已发表文献来看,MCL-1在肿瘤中高表达,通过双荧光素酶报告基因实验验证MCL-1是miR-582-5p的下游靶基因,两者之间确实存在靶向关系,并且通过将肝癌细胞株Huh7中NNT-AS1沉默后,将MCL-1过表达,发现MCL-1能够恢复肝癌细胞Huh7的侵袭和转移能力。这与之前所报导的文献结果一致。

本研究证明NNT-AS1可结合并吸附miR-582-5p介导MCL-1来抑制肝癌细胞的侵袭和转移。此次研究,进一步阐明了肝癌的发展机制和分子网络,为临床肝癌的靶向治疗和分子药物的研发奠定了理论基础。为进一步确认以上结果,还需进一步进行MCL-1的功能回补实验和动物实验。然而,到目前为止,MCL-1与肝癌之间的联系还没有被完全解释清楚,LncRNA NNT-AS1对肝癌的影响是否还有其他路径,MCL-1是通过何种分子机制实现对肝癌细胞发生影响目前尚未探究清楚,后续还有很多工作亟待开展。