苗药验方“四大血”对类风湿性关节炎大鼠关节炎症的作用及机制*

梁玺, 覃淇, 张艺馨, 袁啸天, 吴宁, 吴遵秋*, 吴昌学

(1.贵州医科大学 基础医学院 化学与生物化学实验室, 贵州 贵阳 550025; 2.贵州医科大学 医学分子生物学重点实验室, 贵州 贵阳 550004)

类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis,RA),一种炎症性、破坏性、慢性、可侵犯关节滑膜组织的疾病[1],主要特点为多关节滑膜炎性细胞浸润、关节腔内血管翳生成、成纤维样滑膜细胞增殖导致滑膜内衬层增生,最终引起骨组织破坏和软骨退化;RA临床表现为关节红肿热痛的炎症反应、功能下降、畸形等[2],世界范围内患病率0.4%～1.3%,患者2年致残率50%,3年致残率为70%,现已跃升为医学界的难治疾病[3]。有研究表明,RA患者Nod样受体蛋白3(nod-like receptor protein 3, NLRP3)炎症体轴过度激活,将产生相关细胞因子引起一系列的炎性反应,加剧RA病情[4]。NLRP3炎性体(一种多蛋白复合体),由受体蛋白、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-1前体(pro cysteinyl aspartate specific proteinase,pro-Caspase-1)、细胞凋亡相关斑点样蛋白(apoptosis-associate speck-like protein, ASC)3部分组成,属于炎性体轴的关键蛋白并参与人体固有免疫[5];当NLRP3炎性体激活,形成ASC斑点或焦亡小体,在自催化活化近距离诱导下,可致Caspase激活,从而促进白细胞介素1β(interleukin-1β,IL-1β),IL-18等致炎症因子的成熟及分泌,最终导致周围组织炎症反应加重[6]。在RA的药物治疗方面,新的生物制剂如托珠单抗、IL-1拮抗剂、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-alpha,TNF-α)拮抗剂等,不仅价格高昂,还易发生感染等不良反应;非甾体抗炎药(non-steroidal anti-inflammatory drugs,NSAIDs)、改善风湿病情药物(disease modifying antirheumatic drugs,DMARDs)及糖皮质激素(glucocorticoids,GCs)等常用临床治疗药物,则因疗效不佳、不良反应较明显等问题难以达到患者的期望[7]。当前,从中医药出发,研究疗效更显著、毒副作用更小的新药日渐成为研究热点。苗药验方“四大血”(sidaxue,SX)组成为4味藤本药材鸡血藤(仰嗟嘎,nangx dlob ghat)、黑骨藤(莴蒙棱,vob mongb dlenb)、见血飞(嘎龚布梭学,ghab jongx bel sob xok)及五花血藤(梭向,hsob hx-angt),有通气散血、行瘀止痛之功[8]。本课题组前期结果表明,SX给药后的胶原诱导性关节炎模型大鼠(collagen induced arthritis in rats, CIA)表现出良好的治疗疗效、关节滑膜的炎性细胞浸润可被明显抑制、关节肿胀得到缓解、IL-1β表达下调[9]。本研究以NLRP3炎症体轴为切入点,通过复刻CIA模型大鼠,对比不同剂量SX治疗前后大鼠关节肿胀度及病理变化,并分析大鼠滑膜组织的NLRP3及Caspase-1的蛋白及mRNA水平和血清IL-18含量的变化,评估SX的抗炎效果。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1药材来源 SX组成药材鸡血藤、黑骨藤、五花血藤及见血飞由贵州中医药大学苗医药教研室提供,经贵州中医药大学田振华副教授鉴定为正品。

1.1.2实验动物 42只8～9 周龄、体质量(200±20)g的健康Sprague Dawley(SD)大鼠,雌雄各半,由学校实验动物中心提供[SYXF(黔)2018-0001]。本研究已获得学校实验动物伦理委员会审查批准(2200095),且严格遵守伦理委员会规定。

1.1.3主要药物与试剂 雷公藤多苷片(tripterygium glycosides,GTW;黄石飞云制药公司),弗式不完全佐剂(美国Sigma公司),牛Ⅱ型胶原(美国Chondrex公司),二喹啉甲酸(bicinchoninic acid,BCA)蛋白定量试剂盒、RIPA(radio immunoprecipitation assay,RIPA)裂解液、苏木素、TRIzol及伊红由上海碧云天生物技术有限公司提供,大鼠IL-18 酶联免疫吸附实验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)试剂盒(上海泛柯实业有限公司),大鼠NLRP3抗体(美国abcam公司),Caspase-1抗体(华安生物技术有限公司),辣根过氧化物酶(horse radish peroxidase,HRP)-羊抗兔免疫球蛋白G(immune globulin G,IgG;美国ABclonal公司),高灵敏性染料法定量聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)检测试剂盒和逆转录试剂盒由南京诺唯赞生物科技有限公司提供,其余试剂均为进口或国产分析纯产品。

1.2 研究方法

1.2.1药物的制备 取2 000 g苗药五花血藤、鸡血藤、见血飞及黑骨藤组成SX,按15∶22∶15∶8的比例取药材600 g,加适量水用大火、中火及小火分别煮1 h、30 min及30 min,合并浓缩液500 mL作为受试药,浓度为4 kg/L(按生药量计),质量控制标准为每制150 mL;SX水煮液原药材五花血藤不低于150 g、鸡血藤不低于220 g,见血飞不低于150 g及黑骨藤不低于80 g;制备完成的中药水煎液密封避光,4 ℃冰箱备用(保存1周)。

1.2.2造模及分组 42只SD大鼠于无特定病原体(specific pathogen free,SPF)级实验室适应性喂养7 d,按体质量随机均分为空白组、阳性对照组、模型组及10 g/kg(低剂量)SX组、20 g/kg(中剂量)SX组、40 g/kg(高剂量)SX组。取适量2 g/L牛Ⅱ型胶原与等量不完全弗氏佐剂于冰上混合,并完全乳化至其滴于水中不扩散;将模型组、阳性对照组及高、中、低剂量SX组大鼠于尾根部皮下注射乳化剂200 μL诱导免疫反应,1周后再次注射乳化剂100 μL加强免疫;空白组大鼠于尾根部皮下注射同量生理盐水。造模期间每日观察并拍照记录大鼠关节红肿及畸形等情况,每隔7 d观察并进行关节炎指数评分(arthritis index score,AI),AI评分>2分即可视为造模成功[10]。

1.2.3给药方案 造模成功2 d后,高、中、低剂量SX组分别按照体质量40 g/kg、20 g/kg、10 g/kg给予SX浓缩液4 000 g/L、2 000 g/L、1 000 g/L(按生药量计),阳性对照组按体质量 40 g/kg给予GTW4 000 g/L,空白组及模型组给予等量生理盐水(normal saline,NS),1次/d,持续给药21 d。

1.2.4一般情况的观察和AI评分 给药期间观察各组大鼠的饮食量、精神状态、踝关节形态、被毛情况及活动情况等。分别于造模前1天、灌胃给药前1天及灌胃给药1周、2周、3周时,采用足趾容积测量仪测各组大鼠足趾大小,记录AI评分;足趾肿胀指标判断以大鼠造模前后的足趾容积变化为准,双后足累积得分作为总分。

1.2.5标本采集 末次给药次日,各组大鼠经100 g/L水合氯醛麻醉,麻醉处死大鼠,取仰位固定,沿膝关节正中将皮肤纵行切开、暴露3 cm×3 cm以膝关节为中心的区域,齿镊提起髌骨,从上缘0.5 cm处沿两侧向下分离,膝关节腔内可见附着的薄层滑膜组织,呈淡黄色、平滑、光亮,小心剥离后用磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline,PBS)清洗,液氮速冻,-80 ℃保存,并提取滑膜组织的总RNA及蛋白供后续研究。

1.2.6病理组织切片制备 取各组大鼠踝关节组织,中性甲醛固定24 h,常规梯度脱水后依次进行浸蜡、包埋、切片与贴片、脱蜡水化、苏木精-伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色,脱蜡水化、脱苯、复水、常规梯度染色、梯度脱水、二甲苯透明、中性树胶封片,在显微镜下观察滑膜组织形态学变化。

1.2.7酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbnent assay,ELISA)法检测血清IL-18的表达 各组大鼠心脏取血后离心并取上层血清,采用ELISA法检测大鼠血清 IL-18含量,按照试剂盒说明书进行操作,配置标准品液,每孔分别加标准品和待测样品100 μL,洗板后加一抗于37 ℃放置20 min,再次洗板并加酶标抗体于37 ℃放置10 min),洗板并加底物工作液于7 ℃放置15 min,最后加终止液并混匀,测量酶标仪450 nm处吸光值。

1.2.8即时聚合酶链式反应(real-time polymerase chain reaction,Real-time PCR)法检测滑膜组织NLRP3及Caspase-1 mRNA的含量 取大鼠关节滑膜组织匀浆,利用Trizol法提取总RNA并吸取澄清的trizol至新的微型离心管(eppendorf,EP)内,依次测定 RNA 样品浓度、纯度,逆转录合成互补脱氧核糖核酸(complementary deoxyribonucleic acid,cDNA)并进行 Real-time PCR 扩增(反应条件:预变性95 ℃ 30 s,变性95 ℃ 10 s、退火60 ℃ 30 s、循环 40 次)。用 2-ΔΔCt法计算 mRNA 的相对表达量,3次平行实验后,对目的基因扩增产物与甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)光密度值进行统计学分析。通过NCBI Primer-blast 网站设计引物,由武汉天一辉远生物科技有限公司合成引物,GAPDH为内参基因,引物序列见表 1。

表1 各基因的引物序列

1.2.9Western bolt检测滑膜组织NLRP3、Caspase-1蛋白表达 取各组大鼠关节滑膜组织,置于已加放射免疫沉淀法(radio-immunoprecipitation assay,RIPA)裂解液2 mL的研磨管,充分研磨,4 ℃静置裂解30 min,4 ℃下12 000 r/min 离心15 min取上清液,BCA法测定蛋白浓度;依次制备10%聚丙烯酰胺凝胶,上样20 μg,80～120 V电泳2 h,300 mA恒流转膜1 h,5%脱脂奶粉封闭2 h,一抗(1∶1 000)于4 ℃孵育过夜,HRP 辣根过氧化物酶偶联二抗(1∶5 000)室温孵育2 h,经增强型化学发光试剂(enhanced chemiluminescence,ECL)工作液显色及曝光成像。采用条带分析软件处理条带,并计算灰度值,蛋白的表达量为条带与各组内参β-actin灰度值的比值。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 足趾外观及双后肢足肿胀度的AI评分

CIA大鼠足趾外观结果显示,给药21 d后,各给药组较模型组大鼠双后肢红肿情况存在不同程度的降低,其双后肢膝关节、踝关节和趾间关节红肿均有不同程度的减轻。给药前,空白组的AI评分为0分,其余各组AI评分均为4分;根据评分标准(达2分及以上即可判断造模成功)可判断本次造模情况达标。连续灌胃给药1周后,高、中剂量SX组大鼠双后肢足肿胀度较模型组下降(P<0.05);灌胃给药2周后,各剂量SX和阳性对照组大鼠后肢肿胀程度较模型组均有较多降低(P<0.05);到给药3周时,各剂量SX和阳性对照组大鼠双后肢足肿胀度和足趾外观表现较模型组均有明显减小(P<0.05)。且除模型组AI评分为3分,其余各组均为0分(P<0.05)。见图1和表2。

空白组 阳性对照组 模型组 低剂量SX组 中剂量SX组 高剂量SX组

表2 各时间点各组大鼠双后肢足肿胀度的AI评分

2.2 组织学特征

光镜下观察时可见,空白组大鼠未见明显滑膜增生及炎症细胞浸润;相比空白组,模型组大鼠踝关节组织可见踝关节组织软骨表面粗糙不平、破骨细胞增多,软骨细胞坏死,衬里下层细胞坏死,衬里层的滑膜细胞存在坏死或增生,且存在浸润性炎性细胞、增生性纤维组织、形成新生毛细血管等病理改变;与模型组相比,各给药组大鼠踝关节组织病理改变均有所减轻,其中低剂量SX组、中剂量SX组仍可见较多浸润性炎性细胞、组织水肿;阳性对照组大鼠浸润性炎性细胞明显减少,表示踝关节组织炎症有一定程度减轻;高剂量SX组大鼠明显缓解,偶见极少量散在分布的炎性细胞。见图2。

注：绿色、蓝色黄色及橙色箭头分别表示淋巴细胞、中性粒细胞、浆细胞及纤维细胞。

2.3 血清IL-18水平

ELISA检测结果表明(表3),与空白组比较,模型组大鼠血清IL-18水平升高(P<0.05);与模型组比较,阳性对照组和SX高剂量组大鼠的血清IL-18水平下降(P<0.01),SX中、低剂量组大鼠血清IL-18水平下降、但无统计学意义(P>0.05);与阳性对照组比较,SX高剂量组大鼠的血清IL-18水平比较、差异无统计学意义(P>0.05)。

表3 各组大鼠的血清IL-18 水平

2.4 NLRP3和Caspase-1 mRNA的表达

qRT-PCR检测结果表明(图3),给药21 d后,与空白组比较,模型组大鼠膝关节滑膜组织中NLRP3、Caspase-1 mRNA明显上调(P<0.01);与模型组比较,高剂量SX组大鼠膝关节滑膜组织中NLRP3、Caspase-1 mRNA下调,但差异无统计学意义(P>0.05),中剂量SX组大鼠膝关节滑膜组织中NLRP3、Caspase-1 mRNA明显下调(P<0.01),SX低剂量组NLRP3 mRNA下调(P<0.05),提示中、低剂量SX组对CIA大鼠的NLRP3和Caspase-1 mRNA下调效果良好。

注：A、B分别为NLRP3和Caspase-1 mRNA的定量表达; (1)与空白组比较,P<0.05;(2)与模型组比较,P<0.05;(3)与阳性对照组比较,P<0.05。

2.5 NLRP3和Caspase-1蛋白的表达

Western blot结果显示(图4),与模型组比较,空白组大鼠膝关节滑膜组织中NLRP3、Caspase-1蛋白表达上调(P<0.05),中、低剂量SX组大鼠膝关节滑膜组织中NLRP3、Caspase-1蛋白表达下调(P<0.05),中剂量SX组大鼠膝关节滑膜组织中NLRP3、Caspase-1蛋白表达下调与阳性对照组作用相当(P>0.05),提示中剂量SX组对CIA大鼠膝关节滑膜组织中NLRP3和Caspase-1蛋白下调效果良好。

注：A为Caspase-1、NLRP3蛋白的Western blot检测结果,B、C分别为Caspase-1、NLRP3蛋白的定量结果;(1)与空白组比较,P<0.05;(2)与模型组比较,P<0.05;(3)与阳性对照组比较,P<0.05。

3 讨论

RA属一种自身免疫性疾病,主要病变特征为侵蚀性关节炎,最终可导致肢体残疾,影响生活质量[11]。我国RA患病率约为0.42%[12]。RA基本病理变化为关节滑膜炎形成、腔内具有浸润性炎性细胞、骨侵蚀及软骨破坏,其中炎症反应是RA主要的发病机制之一,多种炎症因子与之密切相关,促炎细胞因子(IL-1β、IL-18及TNF-α等)介导的炎症反应是RA滑膜病变发生发展的重要原因[13]。核因子κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)信号通路调控NLRP3炎症体轴的激活[14]。有研究表明,RA患者外周血细胞中NLRP3炎症小体的增加表达[15];小鼠 Caspase-1下游因子焦孔素家族蛋白D(gasdermin-D,GSDMD)的缺失可以明显缓解CIA小鼠的滑膜炎和临床表现[16]。综合以上表明,RA中存在NLRP3炎症体轴的过度激活,但NLRP3炎症体轴对RA炎症反应影响的具体机制仍有待证实。参与细胞死亡及炎症反应是Caspase家族主要作用,且炎症小体在Caspase-1的活化过程中具有关键作用[17]。炎症小体是由pro-Caspase-1蛋白、细胞凋亡相关斑点样蛋白(apoptosis-associate speck-like protein, ASC)、受体蛋白3部分组装而成的多蛋白复合体[18];其最具特征的亚型之一是由NLRP3作为受体蛋白的NLRP3炎症小体,主要依靠结构域之间的结合激活Caspase-1[19];GSDMD作为Caspase-1下游的关键因子,可直接实施损伤细胞,其活性的N端结构可破坏细胞膜的完整性并形成孔道,最终导致细胞死亡[20];pro-IL-18、pro-IL-1β的成熟与活化依赖于Caspase-1的活化,待其分泌至细胞外,将进一步诱导其他炎症细胞因子、粘附分子及趋化因子等的合成,从而扩大炎症反应[21]。基于NLRP3炎症体轴使用SX治疗RA的研究,尚且未见相关报道,因此,本研究旨在探究苗医验方SX是否能通过干预NLRP3炎症体轴发挥抗炎作用。苗药验方SX有4味藤本药材:见血飞、鸡血藤、黑骨藤及五花血藤,具通气散血、行瘀止痛的功效,是RA治疗的贵州苗族地区特色药方[18]。从本研究结果来看,与空白组相比,模型组大鼠足趾肿胀明显,组织切片提示滑膜细胞明显增生、炎症细胞浸润明显,血清IL-18水平存在明显上调,滑膜组织中NLRP3、Caspase-1 mRNA水平和蛋白表达升高,提示模型制备成功;NLRP3过度表达可引起过度激活NLRP3炎症体轴的表现。NLRP3炎症体轴的正常激活可以保护正常组织器官避免内源性损害及感染,过度激活则可能引发病理性炎症[22]。过度表达的NLRP3炎症小体,可激活Caspase-1,促进IL-1β、IL-18的成熟与分泌,引起细胞内容物、炎症因子IL-1β及IL-18的大量释放,加重周围组织炎症反应;IL-1β的刺激,又可促进滑膜细胞的过度增殖、血管翳的形成[23]。经过SX或GTW治疗后,大鼠足趾肿胀度相对改善,关节滑膜组织中的细胞增生程度较轻,炎症细胞浸润明显减少,提示SX可抑制RA中的炎症反应,其中四大血高剂量组较低、中剂量组炎症反应缓解更加明显;与模型组相比,四大血中剂量组大鼠滑膜组织的NLRP3、Caspase-1蛋白和mRNA表达明显下调,其余治疗组表达轻度下调;四大血阳性对照组及高剂量组血清中IL-18水平降低;可见SX具有抑制NLRP3炎症小体的可能,从而抑制NLRP3炎症体轴的激活[24]。

综上所述,CIA大鼠滑膜组织的炎性增生可能与过度激活的NLRP3炎症体轴有关;SX可下调NLRP3表达,减弱了NLRP3炎症信号通路的活化,下游Caspase-1的表达则被抑制,从而缓解RA大鼠滑膜组织中被过度激活的NLRP3炎症体轴、抑制滑膜炎症,起到治疗RA的作用。因此,本研究提示SX减轻炎性症状的作用与NLRP3炎症体轴密切相关,具有重要的药用价值。同时,为SX治疗RA的作用靶点的研究搭建了一定的实验基础,但仍需进一步深入研究具体机制。