PMN-MDSCs细胞对异基因造血干细胞移植术后患者T淋巴细胞增殖及干扰素-γ分泌的影响*

陈璐, 倪明, 王力, 潘成云, 亢倩, 詹雲, 赵鹏, 王季石,3***

(1.贵州医科大学附属医院 血液内科, 贵州 贵阳 550001; 2.贵州医科大学 临床医学院, 贵州 贵阳 550004; 3.苏州大学附属第一医院 国家血液病临床研究中心, 江苏 苏州 215006)

异基因造血干细胞移植(allogeneic hematopoietic stem cell transplantation, allo-HSCT)术后可发生多种并发症,其中较典型且严重的为移植物抗宿主病(graft-versus-host disease, GvHD)[1-3],Ⅱ及Ⅲ～Ⅳ度急性GvHD(acute GvHD, aGvHD)患者的3年生存率分别为54%和26%[4]。随着免疫学研究的不断进展,有学者认为免疫调节疗法取代目前的免疫抑制疗法是未来aGvHD治疗所追求的目标[5]。髓系来源的抑制性细胞(myeloid-derived suppressor cells, MDSCs)是一群具有免疫抑制性的髓细胞,最主要的功能是抑制由固有免疫和获得性免疫介导的反应[6]。大量研究表明,MDSCs已成为癌症、感染、慢性炎症及自身免疫性疾病中的主要免疫抑制细胞,提示MDSCs可能有助于控制GvHD[7-8]。目前,针对各亚型MDSCs通过不同机制预防及控制aGvHD的研究基本仅限于动物模型[9-10],体外实验也仅限于现象学观察,缺乏相关机制学研究[6,11]。因此,本研究主要通过流式分选出allo-HSCT术后患者新鲜外周血中多形核的MDSCs(polymorphonuclear-MDSCs, PMN-MDSCs)及T淋巴细胞,采用共培养方式探究人PMN-MDSCs对T淋巴细胞增殖、经典淋巴因子干扰素-γ(interferon-γ, IFN-γ)分泌的免疫抑制作用,为临床PMN-MDSCs作为aGvHD防治策略提供理论和实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1样本来源及分组 选取2022年11月—2023年1月allo-HSCT术后患者16例及健康供者8例,要求符合术前接受清髓治疗、术后临床确诊巨细胞病毒(cytomegalovirus, CMV)感染,排除行自体造血干细胞移植(autologous hematopoietic stem cell transplantation, AHSCT)术患者、临床资料不完善者及患传染性疾病(如乙肝、梅毒、艾滋病等)患者。取患者移植完成后第80天时及健康供者任意时间点新鲜外周血(未过夜)作为标本来源。本研究已根据《赫尔辛基宣言》获得了病人以及供者知情同意。

1.1.2主要试剂及仪器 抗分化簇14抗体-APC(anti-cluster of differentiation 14-APC, anti-CD14-APC)、抗人类白细胞抗原DR抗体(anti-human leukocyte antigen-DR, anti-HLA-DR)及anti-CD11b(美国Thermo Fisher Scientific公司),anti-CD3、anti-CD16、anti-CD14-FITC、anti-CD15、anti-CD33、anti-CD19及 anti-CD4(美国Beckman Coulter公司),anti-CD8(中国QuantoBio公司),anti-CD3、anti-CD56、红细胞裂解液及细胞破膜液(美国BD Biosciences公司),羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(carboxyfluorescein succinimidyl ester, CFSE)细胞增殖与示踪检测试剂盒、CD3/28单抗偶联磁珠(美国BioLegend公司),人白细胞介素-7(human interleukin-7, hIL-7)及人白细胞介素-15重组蛋白(human interleukin-15 recombinant protein, rhIL-15;美国Cell Signaling Technology公司),人外周血中性粒细胞分离液、瑞氏-姬姆萨复合染色试剂盒及Tween20(中国Solarbio公司),Annexin V-APC/7-AAD荧光双染细胞凋亡检测试剂盒(中国杭州联科生物技术股份有限公司),萤光酶联免疫斑点(enzyme-linked immunospot, ELISpot)试剂盒、CMV肽段池(cytomegalovirus peptide pool, CMV pool;美国Mabtech 公司),7-氨基放线菌素D(7-aminoactinomycin D, 7-AAD)、标准透明96孔U型底细胞培养板[中国爱必信(上海)生物科技有限公司],1×磷酸盐缓冲液(phosphate buffered solution, PBS;中国兰杰柯科技有限公司),Roswell Park Memorial Institute(RPMI)-1640培养基、青霉素-链霉素混合液(中国武汉普诺赛生命科技有限公司),胎牛血清(fetal bovine serum, FBS;中国浙江天杭生物科技股份有限公司),完全培养基配方为RPMI-1640 45 mL+FBS 5 mL+青霉素-链霉素混合液500 μL,5 mL流式试管(墨西哥FALCON公司),流式分选仪和流式细胞仪(美国BD Biosciences公司),CX41型显微镜(日本OLYMPUS公司),荧光酶联免疫斑点分析仪(德国BIO-SYS公司)。

1.2 研究方法

1.2.1血液标本 抽取allo-HSCT术后患者移植完成后第80天时及健康供者任一时间点的空腹外周血。

1.2.2分离PMN-MDSCs与T细胞 2组受检者新鲜外周血标本置于50 mL试管中,加预先放置的中性粒细胞分离液10 mL,室温下1 800 r/min离心30 min,吸出分层的2层细胞(包含了所有白细胞),1×PBS缓冲液洗涤2次(2 000 r/min离心5 min)。

1.2.3分选PMN-MDSCs与T细胞/PMN-MDSCs 取“1.2.2”项下2组受检者白细胞置于5 mL流式试管中,室温下2 000 r/min离心5 min,1×PBS缓冲液50 μL重悬,分别加PMN-MDSCs及T细胞的分选抗体组合,即对于PMN-MDSCs使用CD33、CD11b、HLA-DR及CD14-APC,对于T细胞则使用CD3、CD16、CD56、CD14、CD15、CD33及CD19进行染色,常温避光孵育15 min;1×PBS缓冲液500 μL洗涤细胞1次,加1×红细胞裂解液1mL裂解红细胞,常温避光孵育10 min;1×PBS缓冲液洗涤,完全培养基重悬。遵循FACS Melody手册建立无菌管路,使用无菌生理盐水作为鞘液进行分选,承接分选细胞的无菌流式管中预先加FBS 2 mL,收集细胞数上限为7.2×105个/管;分选结束后立刻迅速将细胞转移至37 ℃、5% CO2培养箱中备用。

1.2.4瑞氏-姬姆萨(Weigert-Giemsa, WG)染色 取“1.2.3”项下2组受检者PMN-MDSCs混匀滴至载玻片、推片、常温晾干,使用移液器悬滴WG染色液(A液)至载玻片、覆盖涂片区、常温孵育3～5 min;滴加等量WG缓冲液(B液),晃动玻片与A液均匀混合,再使用60 mL洗耳球充分混匀A、B液,常温孵育3～5 min;生理盐水洗去染色剂,玻片于常温晾干;用显微镜阅片(放大倍数为100倍),比较allo-HSCT术后患者及健康供者PMN-MDSCs形态学差异。

1.2.5检测PMN-MDSCs凋亡(Annexin V-APC/7-AAD法) 取“1.2.3”项下allo-HSCT术后患者PMN-MDSCs于室温2 000 r/min离心5 min,用预冷1×PBS 1 mL洗涤,2 000 r/min离心5 min;ddH2O稀释5×Binding Buffer为1×工作液,取1×Binding Buffer 500 μL重悬细胞;5 mL流式试管中加Annexin V-APC 5 μL和7-AAD 10 μL,涡旋混匀,室温避光孵育5 min;运用BD FACSLyricTMFlow Cytometer进行0 h细胞凋亡检测及分析,后续按12 h、24 h、48 h时间点对PMN-MDSCs凋亡情况各检测1次。

1.2.6CFSE染色 96孔U形板每孔加1 mg/L抗CD3/28抗体50 μL,铝箔包裹96孔板,4 ℃孵育过夜;取出96孔板,吸出残留的抗体,每孔加完全培养基200 μL,37 ℃的5%CO2培养箱孵育30 min,孵育的同时取“1.2.3”项下allo-HSCT术后患者T细胞于室温下2 000 r/min离心5 min;用1 mL含有5 μmol/L CFSE染液的 1×PBS缓冲液重悬并染色T细胞,室温避光孵育5 min;加5倍体积的完全培养基终止反应后于室温下洗涤T细胞,2 000 r/min离心5 min,重复上述洗涤2遍,重悬T细胞至2.0×109个/L备用;96孔板孵育结束后吸出培养基,根据实验设计加入不同比例(即T细胞∶PMN-MDSCs=1∶0,1∶1,1∶5,1∶10)CFSE染色完毕的T细胞及“1.2.3”项下allo-HSCT术后患者PMN-MDSCs,置于37 ℃的5%CO2培养箱共培养5 d;共培养的第2天,每孔加10 μg/L IL-7和IL-15增殖培养;共培养结束后收集各孔细胞,置于5 mL流式试管,按照细胞表面标志物染色流程进行抗CD4、CD8及7-AAD染色后流式上机判断T细胞增殖、分裂情况,采用Flowojo 10.6.2(美国BD Bioscience公司)软件进行量化比较。

1.2.7ELISpot实验 35%酒精20 μL/孔加至ELISpot板中,室温避光孵育1 min;去酒精,每孔中加1×PBS缓冲液200 μL洗涤,重复5次;加抗IFN-γ抗体(1-D1K)100 μL,铝箔包裹ELISpot板,4 ℃孵育过夜;取出ELISpot板,甩去残留抗体,每孔加1×PBS缓冲液200 μL 洗涤2遍,加含10% FBS的1×PBS封闭液,常温避光孵育2 h;甩去封闭液,每孔加1×PBS缓冲液200 μL洗涤5遍;各孔加“1.2.3”项下allo-HSCT术后患者5.0×104个T细胞[实验组加5.0×104个PMN-MDSCs(即T细胞∶PMN-MDSCs=1∶1),对照组不加入PMN-MDSCs(即T细胞∶PMN-MDSCs=1∶0)],再加刺激物2 mg/L CMV 1 μL、1 mg/L可溶性CD3/28 50 μL(2种刺激物下的各组均设置3个孔),将ELISpot板置于37 ℃的5% CO2培养箱中共培养36 h;甩去细胞,含0.05% Tween20的1×PBS缓冲液20 μL,洗涤5次,每孔加1 mg/L 7-B6-1-biotin 100 μL,室温避光孵育2 h;含0.05% Tween20的1×PBS缓冲液20 μL,洗涤5次,每孔加1 mg/LHRP 100 μL,室温避光孵育1 h;含0.05% Tween20的1×PBS缓冲液洗涤4次,1×PBS洗涤1次;每孔加1∶1 000稀释的AEC 50 μL,室温下避光孵育5 min,用流动自来水终止反应;采用ELISpot分析仪对各孔IFN-γ分泌情况进行拍照解读。

2 结果

2.1 PMN-MDSCs形态特征

allo-HSCT术后患者PMN-MDSCs大多呈不成熟粒细胞表型,细胞核占胞质比例大,无明显分叶;健康供者PMN-MDSCs则呈成熟粒细胞表型,细胞核所占比例小,有明显分叶。见图1。

患者 健康供者

2.2 PMN-MDSCs凋亡检测

allo-HSCT术后患者部分PMN-MDSCs于24 h时出现早期凋亡,48 h时出现晚期凋亡,但大部分PMN-MDSCs于48 h时仍处于存活状态。见图2。

图2 allo-HSCT术后患者PMN-MDSCs不同时间点的凋亡检测(Annexin V-APC/7-AAD)

2.3 PMN-MDSCs与T淋巴细胞共培养

CFSE染色实验结果显示(图3), allo-HSCT术后患者PMN-MDSCs可抑制由在CD3/CD28单抗偶联磁珠刺激下所引起的T细胞非特异性增殖,且这种抑制作用(以T细胞分裂指数表示)随着T细胞与PMN-MDSCs比例的升高而增强。ELISpot检测结果显示(图4),allo-HSCT术后患者PMN-MDSCs可抑制T淋巴细胞在CD3/28或CMV pool刺激下IFN-γ的释放。

注：A为共培养后荧光图,B为T细胞分裂曲线图。

3 讨论

研究发现,多形核MDSCs有着粒细胞来源的特性,既不能冻存,也不能使用人外周血淋巴细胞分离液(human lymphocyte separation medium, FICOLL)进行分离[12-13]。鉴于MDSCs的临床标本不易保存,因此对MDSCs的大量研究尚停留于动物模型阶段[9-11,14-15]。目前,围绕MDSCs并结合 allo-HSCT后病人的临床预后及转归资料进行的探索屈指可数,而针对PMN-MDSCs与allo-HSCT的研究尚比较缺乏。Wang等[11]在动物模型体内围绕MDSCs所展开的一系列研究发现HLA-DR-/lowCD33+CD16-early-MDSCs对预防人源化小鼠aGvHD能够起到一定作用;Messmann等[16]在小鼠移植的同时回输MDSCs,结果表明MDSCs可改善GvHD严重程度,并使GvHD 评分从90%下降至30%。T淋巴细胞可分为CD4+辅助T淋巴细胞和CD8+细胞毒性T淋巴细胞[17]。一般认为,在aGvHD中主要发挥作用的是CD8+T淋巴细胞[18-19]。一方面,T淋巴细胞受到抗原刺激后可发生增殖、分化,幼稚的CD4+和CD8+T细胞分化为大量效应细胞,进入外周血并迁移到炎症组织以对抗感染或肿瘤[20-21];另一方面,T淋巴细胞被抗原激活后立即行使杀伤、释放细胞因子等功能[22]。前一方面的作用,本研究采用CFSE染色观察PMN-MDSCs对T淋巴细胞增殖情况的影响,结果表明PMN-MDSCs可抑制由CD3/28非特异性诱导的 CD8+T细胞的增殖,而对CD4+T细胞并无明显抑制作用;后一方面的作用,本研究使用ELISpot进行评价,结果亦表明,PMN-MDSCs可同时抑制由CD3/28非特异性诱导及CMV pool特异性诱导的T淋巴细胞内细胞因子的释放。总之,上述结果可以说明PMN-MDSCs具有免疫抑制功能,这和广泛的动物研究结果认为MDSCs具有免疫抑制功能相符合[8,11]。

综上所述,本研究表明PMN-MDSCs具有抑制allo-HSCT术后患者自身T淋巴细胞增殖及激活的功能。因此,可以预见PMN-MDSCs在患者移植后早期可能降低了aGvHD发生率,并且缓解了aGvHD严重程度。这也就使得PMN-MDSCs在临床工作中作为aGvHD防治策略成为可能。