腱蛋白样蛋白2 在胃癌中的表达及临床意义△

吴倍佩，左云，倪晨，朱惠平，张永芹，张王吉，钱晓兰，张敏，蒋健

苏州大学附属张家港医院肿瘤科，江苏 张家港 2156000

胃癌是目前全球范围内第五大肿瘤，每年有超过100 万新发病例，由于胃癌早期诊断率低，大多数患者在诊断时已是晚期，错过了最佳的手术时机，病死率很高，因此胃癌是全球范围内第三大肿瘤死因，在2018 年全球有78.4 万例胃癌患者死亡[1-2]。晚期胃癌患者的主要治疗方法是联合使用放化疗、分子靶向治疗和免疫治疗，但疗效并不理想，患者5 年生存率仅为30%～40%[2-3]。因此，探索具有诊治价值的生物标志物对胃癌患者早期诊断、治疗及预后评估具有重要临床意义。骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）属于转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）超家族，可调控上皮细胞更新、增殖和分化，还具有强大的抗肿瘤活性[4]。腱蛋白样蛋白2（chordin like 2，CHRDL2）是一种分泌蛋白，是BMP 的拮抗剂，可以阻止BMP 与其识别的细胞表面受体相互作用[5-6]。研究发现，CHRDL2 高表达与乳腺癌、结直肠癌、骨肉瘤的预后不良相关[7-9]。目前国内尚无CHRDL2 表达与胃癌患者预后关系的相关报道，本研究探讨胃癌组织中CHRDL2 的表达情况，并分析CHRDL2 表达情况与胃癌患者临床特征的关系及对预后的影响，现报道如下。

1 对象与方法

1.1 研究对象

选取2015 年1 月至2016 年6 月于苏州大学附属张家港医院接受手术治疗的86 例胃癌患者作为研究对象，术中取得86 例胃癌组织及79 例对应的癌旁组织。所有患者均经病理检查确诊为胃腺癌，未合并其他肿瘤，并且均未行术前放化疗及其他抗肿瘤治疗。86 例胃癌患者中，男性56 例，女性30 例；平均年龄（67.74±12.74）岁。本研究经医院伦理委员会批准通过，所有患者均知情同意。

1.2 主要试剂

兔抗CHRDL2 多克隆抗体购自艾博抗（上海）贸易有限公司，生物素高效标记山羊抗兔二抗、二氨基联苯胺（diaminobenzidine，DAB）辣根过氧化物酶显色试剂盒均购自上海碧云天生物技术有限公司。

1.3 免疫组化染色方法

术中取得的新鲜胃癌组织及癌旁组织标本均经10%甲醛固定，石蜡包埋后进行4 μm 厚连续切片。将石蜡切片进行二甲苯、梯度乙醇脱蜡和水化；用3%过氧化氢消除内源性过氧化物酶活性，室温避光孵育20 min，磷酸盐缓冲液洗涤5 min×3次；加入柠檬酸钠缓冲液进行抗原修复；滴加10%正常山羊血清室温封闭30 min；滴加兔抗CHRDL2多克隆一抗（1∶100）于4 ℃孵育过夜；待切片复温后采用磷酸盐缓冲液洗涤5 min×3 次，加入生物素高效标记的山羊抗兔二抗室温孵育40 min；磷酸盐缓冲液洗涤5 min×3 次，滴加链霉亲和素-生物素复合物（streptavidin-biotin complex，SABC）工作液孵育30 min；磷酸盐缓冲液洗涤5 min×3 次，滴加DAB 显色，在光学显微镜下控制显色程度；苏木精复染、脱水、透明、封片。

1.4 免疫组化染色结果判定

CHRDL2 定位于细胞质，染色细胞中见棕黄色颗粒状蛋白。免疫组化结果由3 名资深病理科医师同时读片评分，若结果不一致，则复阅达成一致意见。每张切片随机计数10 个高倍视野（×200），每个视野计数100 个细胞并统计分数。按阳性细胞所占比例评分：无阳性细胞计0 分，≤25%计1 分，26%～50%计2 分，51%～75%计3 分，＞75%计4 分。按染色强度评分：无着色计0 分，淡黄色计1 分（+），黄色或棕黄色计2 分（++），棕褐色或褐色计3分（+++）。总评分=阳性细胞所占比例评分×染色强度评分，总评分≤4 分为CHRDL2 低表达，5～12 分为CHRDL2 高表达。

1.5 随访

以门诊复诊或电话等方式对胃癌患者进行随访，总生存期为术后至随访截止时间（2022 年7 月）或患者死亡时间，记录患者预后情况，分析CHRDL2 蛋白表达水平与胃癌患者预后的关系。

1.6 统计学方法

采用SPSS 26.0 统计软件进行数据分析，计数资料以例数及率（%）表示，组间比较采用χ2检验；符合正态分布的计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用t检验；采用Kaplan-Meier 法绘制生存曲线，生存情况的比较采用Log-rank 检验；影响因素分析采用Cox 多因素回归分析；以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 胃癌组织与癌旁组织中CHRDL2 表达情况的比较

免疫组化结果显示，胃癌组织中CHRDL2 阳性表达呈棕黄色，主要位于细胞质（图1）。79 例胃癌组织标本中，49 例（62.0%）患者CHRDL2 高表达，30 例（38.0%）患者CHRDL2 低表达；79 例癌旁组织标本中，16 例（20.3%）患者CHRDL2 高表达，63 例（79.7%）患者CHRDL2 低表达；胃癌组织中CHRDL2 蛋白高表达率明显高于癌旁组织，差异有统计学意义（χ2=28.464，P＜0.01）。

图1 胃癌组织及癌旁组织中CHRDL2的表达情况（免疫组化染色，×200）

2.2 不同临床特征胃癌患者胃癌组织中CHRDL2蛋白表达情况的比较

不同性别、年龄、病理分级、肿瘤直径、T分期及TNM 分期胃癌患者的胃癌组织中CHRDL2 蛋白表达情况比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）；N1～3期胃癌患者的胃癌组织中CHRDL2 蛋白高表达率高于N0期患者，差异有统计学意义（P＜0.05）。（表1）

表1 不同临床特征胃癌患者胃癌组织中CHRDL2 蛋白表达情况的比较

2.3 不同CHRDL2 蛋白表达情况胃癌患者预后的比较

CHRDL2 低表达患者的总生存率高于CHRDL2 高表达患者，差异有统计学意义（χ2=5.196，P=0.023）。（图2）

图2 CHRDL2蛋白高表达（n=54）与低表达（n=32）胃癌患者的生存曲线

2.4 胃癌患者预后影响因素的单因素及多因素Cox 回归分析

单因素Cox 回归分析结果显示，CHRDL2 表达、病理分级、肿瘤直径、T 分期、N 分期、TNM 分期可能是胃癌患者预后的影响因素。将单因素分析中差异有统计学意义的因素纳入Cox 多因素回归分析，结果显示，肿瘤直径＞5 cm、TNM 分期为Ⅲ～Ⅳ期均为胃癌患者预后的独立危险因素（P＜0.05）。（表2）

表2 胃癌患者预后影响因素的单因素及多因素Cox 回归分析

3 讨论

胃癌是一种侵袭性疾病，5 年生存率低，全球疾病负担沉重。目前，尽管许多基因在胃癌中的作用机制尚不清楚，但它们对预后的预测价值已被确定，可以根据肿瘤的生物学行为和对系统治疗的反应来对患者进行分层[10]。

BMP 是一种重要的分泌型细胞因子，是TGF-β超家族中的一员，也是TGF-β超家族的细胞内信号转导媒介[11-12]，能够抑制肿瘤的发生[13-16]。CHRDL2是BMP 细胞外拮抗剂，是与BMP 配体结合以干扰其功能的分泌性蛋白，可以下调TGF-β超家族信号，促进肿瘤发展。有研究发现，通过抑制剂Noggin拮抗BMP2 加速了胃癌细胞的增殖[17]。研究表明，CHRDL2 不仅在乳腺癌中高表达，而且在肺癌和结肠癌中也高表达[9]。据报道，高水平CHRDL2 通过上调细胞周期蛋白D1（cyclin D1）和下调p21 来促进结直肠癌细胞在体外和体内的增殖，并且证明高水平CHRDL2 与结直肠癌患者的预后不良相关[8]。此外，CHRDL2 在骨肉瘤中表达上调，并且通过激活BMP9/磷脂酰肌醇-3-羟激酶（phosphatidylinositol 3-hydroxy kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，PKB，又称AKT）信号通路促进骨肉瘤细胞的增殖和迁移[7]。为了研究CHRDL2与胃癌发生发展之间的关系，本研究分析了CHRDL2 在胃癌组织及癌旁组织中的表达情况及对预后的影响。

本研究结果表明，CHRDL2 蛋白位于胃癌细胞的细胞质中，并且胃癌组织中CHRDL2 高表达率明显高于癌旁组织，表明CHRDL2 可能与胃癌发生相关。此外，N1～3期胃癌患者的胃癌组织中CHRDL2 蛋白高表达率高于N0期患者（P＜0.05）；CHRDL2 表达与患者性别、年龄、病理分级、肿瘤直径、T 分期及TNM 分期无关，这表明CHRDL2 可能参与胃癌淋巴结转移。生存分析结果显示，CHRDL2 低表达患者的总生存率高于CHRDL2 高表达患者，表明CHRDL2 可能作为判断胃癌预后的生物标志物。最后，Cox 多因素分析结果表明，CHRDL2 表达不是胃癌患者预后的独立影响因素。

然而，本研究的不足之处在于未深入探讨CHRDL2 对胃癌发生发展的作用机制；其次本研究样本量较少，影响因素分析不够全面，因此在今后的研究工作中需要扩大样本量，同时对胃癌预后的影响因素进行全面探讨。

综上所述，胃癌组织中CHRDL2 呈高表达，CHRDL2 表达与胃癌患者淋巴结转移及生存期有关，CHRDL2 可能作为预测肿瘤发生、发展以及患者预后的新的生物标志物，为胃癌临床诊治提供新思路。