新生儿耳聋基因诊断技术进展研究▲

巢薇 覃凤娴 刘小勇 黄以琛

1 广西柳州市工人医院,柳州市 545000;2 广西柳州市柳铁中心医院,柳州市 545000;3 首都医科大学,北京市 100000

【提要】 耳聋是新生儿出生缺陷疾病之一,而在出生后快速、准确地完成耳聋基因筛查,明确耳聋的分子病因,并针对性地给予干预和治疗,可以有效地避免因聋致哑。近年来随着分子生物学技术的飞速发展,对耳聋基因的研究也更加深入。目前基因芯片技术、高分辨率熔解曲线分析、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术、变性高效液相色谱法、Sanger测序、高通量测序技术等均可运用于耳聋基因诊断。现就新生儿耳聋的遗传学机理和常用的耳聋基因诊断技术进行综述,旨在为临床选择最佳的耳聋诊断检测方案提供参考。

耳聋是人类最常见的听力神经系统缺陷疾病,我国每年约有4万聋儿出生[1]。耳聋的最佳干预时间为出生后6个月内,早期对新生儿开展耳聋基因筛查,及时发现有耳聋表型的患儿,并给予针对性的干预治疗(放置人工耳蜗或助听器等),可以有效地降低因聋致哑的发生率。目前已知的与遗传性耳聋相关的基因有130多个[2]。随着新一代测序技术的广泛应用,除了常见的GJB2、GJB3、SLC26A4 和线粒体12S rRNA 等耳聋基因外,一些罕见耳聋基因如MYO15A、GSDME、IVS1+2T>A等被陆续报告,耳聋的分子致病机制也逐步明确。选择高效、准确的检测方案,对临床诊断明确病因、研究制定诊疗方案尤为重要。本文就常见新生儿耳聋的遗传学机理和常用的检测技术进行综述。

1 新生儿耳聋的遗传学机理

先天性耳聋有70%是由遗传因素导致,30%由外伤、药物、感染等多种因素所致。在遗传方式上,遗传性耳聋分为常染色体显性、常染色体隐性、X染色体连锁和线粒体母系遗传。遗传性耳聋的患儿如没有在出生后6个月内及时干预,后续治疗效果很差,最终将导致因聋致哑的结局。我国14岁以上儿童的耳聋患病率为3.5‰。目前大多数医院开展的遗传性耳聋相关基因检测仍集中在常见4大热点基因:GJB2、GJB3、SLC26A4、线粒体12S rRNA。随着分子生物学技术的飞速发展,基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry,MALDI-TOF MS)、高通量测序技术等先进的基因诊断技术广泛用于临床,一些罕见耳聋基因陆续被发现,进一步完善了耳聋分子遗传学的病因研究。

1.1 GJB2基因 GJB2基因是遗传性耳聋最常见的突变基因,其导致的耳聋占所有遗传性耳聋的50%。GJB2基因编码的缝隙连接蛋白 (connexin,Cx)-26是一种跨膜蛋白,其在内外淋巴液k+循环平衡、细胞信号传导中起着重要的作用。当GJB2基因发生突变时,会生成无功能的Cx-26,从而导致k+回流受阻,影响毛细胞电生理活动,导致听力下降[3]。GJB2基因突变类型的人种差异较大,在我国c.235delC是其最常见的突变类型[4],而白种人以35delG突变为主[5];阿什肯纳兹犹太人则以167delT突变为主[6]。

1.2 SLC26A4基因 SLC26A4基因是仅次于GJB2的第二大耳聋致病基因。SLC26A4基因突变,会引起蛋白翻译框移错误,产生异常的Pendrin蛋白,使内耳淋巴液增加,从而导致大前庭水管扩张,即为大前庭水管综合征[7]。当患者剧烈运动或头部受到撞击时,由于颅内压的变化可能导致耳聋。SLC26A4基因突变类型存在人种差异,高加索人常见突变类型为 707T>C突变、1246A>C突变[8],而我国人群中最常见的突变类型是IVS7-2 A>G,其次是2168 A>G[9-10]。

1.3 线粒体12S rRNA 线粒体12S rRNA基因突变导致的药物性耳聋发生率位居我国遗传性耳聋的第三位,仅次于GJB2和SLC26A4基因突变引起的遗传性耳聋。线粒体12S rRNA基因突变会使其与氨基糖苷类药物的亲和力增加,从而影响相关蛋白质的合成而致聋[11]。线粒体遗传物质的传递方式为母系遗传,因此当患儿母亲检出有线粒体12S rRNA基因突变(无论是均质突变还是异质突变)时,本人及其下一代都应终身禁服氨基糖苷类药物。在我国最常见的线粒体12S rRNA基因突变类型是1555A>G和1494C>T[12]。

1.4 GJB3基因 GJB3基因突变可能会引发机体常染色体显性或隐形遗传性神经性耳聋,主要表现为感音神经性耳聋。GJB3基因c.538C>T位点突变与迟发型高频听力损失有关,其在人群突变检出率较低[13-14]。

1.5 罕见耳聋基因 MYO15A基因编码的肌球蛋白15对维持细胞形态、运动和信号的传导具有重要的生理作用,是维持正常听力的重要组成部分。MYO15A基因c.10250_10252del、c.10419_10423del发生突变会导致重度耳聋[15]。GSDME基因突变相关耳聋是一种常染色体显性遗传疾病,临床表现主要为语后、高频、进行性听力损伤,一般在生后第一个10年发病。黄演林等[16]用二代测序技术对一超大家系(36个成员,3人去世)进行检测,发现家族中有8个听力障碍成员均检出了GSDME基因c.991-2A>G突变。

2 耳聋基因常用检测技术

2.1 基因芯片技术 基因芯片技术在上世纪90年代被提出,包括导流杂交技术和微阵列芯片技术,目前仍是大多数基层实验室进行耳聋基因筛查的主流技术。其主要采用了PCR扩增和DNA反向点杂交相结合的DNA芯片技术。原理是由带有Tag标签序列的基因位点特异性引物实现检测对象的扩增、荧光及生物素标记,之后通过与已知碱基序列的DNA探针杂交配对,通过计算机扫描分析,得到突变位点的检测结果[17]。唐晓惠[18]用导流杂交技术对2 296名新生儿进行4个常见耳聋基因中13个突变位点的检测,阳性率为 2.72%。曹国梅等[19]对1 372名新生儿用微阵列基因芯片技术进行耳聋基因检测,阳性率为5.47%,阳性样本经基因测序(检测基因序列变异的金标准)验证,一致性为99.8%,说明其诊断新生儿遗传性耳聋基因突变类型的效果较好。基因芯片技术检测成本较低、易操作、检测时间短,适合普通人群的热点耳聋基因突变筛查,但仍存在无法检测一些非热点基因突变的缺陷[20]。

2.2 高分辨率熔解曲线分析 高分辨率熔解(high-resolution melting,HRM)技术的原理是在PCR扩增完成后,实时升高温度检测DNA荧光染料与PCR扩增产物的结合情况,根据熔解温度及其对应位置来判读基因是野生型还是突变型[21]。刘亚兰等[22]分别采用实时荧光PCR熔解曲线法和Sanger测序法(金标准)对492例非综合征型感音神经性聋患者同时进行检测,实时荧光PCR熔解曲线法检测出的突变类型与Sanger测序法完全一致,实时荧光PCR熔解曲线法检出2例未知突变的样本,经Sanger测序证实1例为复合杂合突变,1例为均质性突变。王格[23]采用基于实时荧光PCR的探针熔解曲线分析对92份经MALDI-TOF-MS 诊断为耳聋基因携带者的婴儿的脐带血样本进行检测(以DNA测序技术结果作为金标准):其中90份基于实时荧光PCR的探针熔解曲线分析的检测结果与MALDI-TOF-MS检测结果相同,其余2份两种检测方法的结果不同;将这2份样本进行测序分析,发现这2例皆存在SLC26A4:281C>T 位点的杂合突变,而熔解曲线法耳聋基因检测没有包括该位点。HRM曲线分析是一种基于荧光PCR熔解曲线的新型技术,它具有高通量、高灵敏度、高自动化程度、完全闭管操作等优点,结果与Sanger测序技术分析结果基本一致,但比测序技术更省钱、省时、省力,能够满足新生儿耳聋基因突变的临床筛查需求。但其缺点是:检测位点仍有局限,对于一些少见的未知位点的突变仍需通过测序方法进行验证。

2.3 变性高效液相色谱法 变性高效液相色谱(denaturing high performance liquid chromatography,DHPLC)是一种在单链构象多态性分析和变性梯度凝胶电泳基础上发展起来的新型DNA序列突变及多态性分析技术。其原理是在部分或完全变性的条件下,利用杂合双链与纯合双链在色谱柱中保留时间的差异,快速分析单个核苷酸的突变和多态性。门美超等[24]建立了引物延伸DHPLC,该技术克服了传统半变性DHPLC只能定性不能定位的缺点,可同时检测GJB2-235delC、GJB2-299delAT、PDS IVS7-2A>G、C1229T、MT-DNA-A1555G和MT-DNA-C1494T共6种突变。与测序结果进行比对,DHPLC检测结果的符合率为100%。但DHPLC需要特殊仪器,对技术要求高,目前很少应用于临床,主要应用于医学研究中。

2.4 MALDI-TOF MS MALDI-TOF MS技术不需要任何标记物,直接以分子量大小进行基因分型[25]。一台仪器每天可以检测2 000个样本,兼具通量高、准确性高、覆盖位点多、检测周期短的优点,目前很多有条件的实验室都用MALDI-TOF MS方法进行耳聋基因的筛查。余红等[26]应用MALDI-TOF MS对2 725名新生儿4个耳聋基因(共20个位点)进行突变筛查,检出携带率为5.47%。潘丽等[27]采用MALDI-TOF MS对9 775名新生儿进行常见耳聋基因突变筛查,检出携带率为4.2%。上述两个研究中突变基因分型都以GJB2最多,SLC26A4次之,这与国内的新生儿耳聋基因阳性携带现状基本一致[28-30]。

2.5 Sanger测序 Sanger测序是利用双脱氧链终止法的原理对DNA序列进行测定,凭着99.99%的碱基读取准确率一直是基因检测的“金标准”[31]。但Sanger测序由于操作程度复杂、耗时长且通量低,往往只能作为一些少见或未知突变的验证,不适合用于大规模的耳聋人群筛查[32]。

2.6 高通量测序 高通量测序技术又称“下一代测序”(next generation sequencing,NGS)技术。它与Sanger测序的区别在于:NGS能够一次性并行对大量DNA分子进行平行序列测定,并能以相对较少的经费获得海量的DNA序列。NGS开创了包括遗传性耳聋在内的许多遗传性疾病诊断的新纪元[33]。NGS可分为全外显子测序(whole exome sequencing,WES)、Panel测序和全基因组测序(whole genome sequencing,WGS)。

2.6.1 WES 外显子只占基因组的1%,但人类基因组85%的致病突变都发生于外显子区域。WES是指利用序列捕获技术将全基因组外显子区域DNA捕获和富集后进行高通量测序,可以检测出所有基因的蛋白质编码区域的变异,对拷贝数变异和基因结构变异也有一定检出能力,测序深度更高,变异检测更准确。陈鹏辉等[34]利用WES确诊1例常染色体显性遗传性耳聋大家系为穆-韦综合征(Mowat-Wilson syndrome,MWS),发现NLRP3基因的E313K突变为其致病基因突变。该研究利用WES进行基因诊断,首次报告了中国人群的MWS,为耳鼻喉科医生对此自身免疫性综合征性耳聋的认识增加新的内容。曲春燕等[35]采用WES对34例诊断为感音神经性听力损失患儿小家系进行分子病因学的检测和分析,明确了19例患儿的分子病因,其中还发现GATA3基因的c.1327delA突变1例、MYO15A基因的c.8033_8057 delinsG(p.N2678_D2686delinsS)突变1例,均为首次报告。这说明WES检测对于确诊罕见的综合征和非综合征耳聋都非常有意义,检测效率高。但WES检测成本较高、检测周期长、生物信息学分析具有一定难度,故目前不适用于新生儿耳聋基因常规筛查,但可以用于一些已有耳聋表型人群需明确发病基因的验证[36]。

2.6.2 Panel测序 耳聋基因Panel是一种选取与遗传性耳聋相关的基因进行集中高通量测序的技术。基因Panel根据其覆盖的基因数量大小,获取的基因图谱范围不同。3个基因是一个Panel,100个基因也是一个Panel,所以用基因Panel进行基因检测,要首先看基因Panel也就是基因组合中基因数量的多少,选择合适的Panel组合对后续的准确诊断至关重要。Xie等[37]从武汉联合医院招募137名年龄在12岁以下的感音神经性听力损失患者,其中63名失聪儿童接受了127个基因Panel检测(包括127个已知引起耳聋的外显子区域和内含子的核基因),而74名儿童接受了159个突变(包括常见的热点突变)检测。127个基因Panel检测鉴定出了更多的突变基因,包括GJB2、SLC26A4、MYO15A、CDH23和OTOF。通过对接受127个基因Panel检测的儿童进行分析,发现其中有51名失聪儿童携带的变异不包括在159个突变检测位点中,其中36例携带致病性变异或可能的致病性变异。如果这些儿童只接受了159个突变检测,那么其遗传病因学将不会被确定,大量的儿童就会被误诊,这说明Panel基因检测范围更广,可以有效地降低漏诊率[37]。孙毅等[38]使用NGS Panel技术对1 056名新生儿进行 GJB2、SLC26A4、MT-CO1、TMC1、GPR98、DFNA5、MYO7A等18个遗传性耳聋基因的100个位点的检测。该研究检测出耳聋基因突变者77人,检出率为 7.29%,远高于国内新生儿遗传性耳聋携带率的平均数;突变耳聋基因SLC26A4杂合突变检出率最高,GJB2次之,这与国内大多数研究报告的GJB2为主要的遗传性耳聋的突变基因不一致。其原因可能为大多数研究采用的检测方法为基因芯片技术、MALDI-TOF MS,通常只检测4个基因15～30个位点,而孙毅等所做的Panel测序检测了18个基因100个位点,检出阳性率明显较常规方法高,检出突变种类也较常规方法丰富。同时该研究还发现罕见致病位点c.94C>T 1例,同时2名听力检测结果正常的新生儿检测出带有MT-CO1:m.7444G>A的罕见突变。这说明Panel测序检测覆盖率大,可以有效地弥补常规检测方法的不足,发现新的低频突变信息。遗传性耳聋的致病复杂,小基因Panel用时短、经济便捷,而大基因Panel能获得超过50个基因的基因图谱,但费用相对较高。因此在设计耳聋基因Panel时,需要根据耳聋表型在尽量减少花费的情况下制定覆盖面广又有针对性的检测方案,早期、快捷地发现耳聋基因并进行有效的干预[39]。

2.6.3 WGS WGS是对整个基因组进行测序,覆盖了外显子和内含子,是目前NGS中最全面的测序技术。WGS所覆盖的区域是WES的50～100倍,可全面地挖掘基因序列差异和结构变异,包括单碱基突变、拷贝数变异、结构变异、内含子突变等。虽然WGS的优势明显,但是其价格成本昂贵、用时长、工作量大,目前仅作为遗传性耳聋WES检测之后的补充诊断方法[40]。

3 展 望

随着基因检测技术的飞速发展,临床对耳聋的发病机制也有了进一步的深入研究。传统的基因芯片检测由于通量低、只能检测15～30个热点位点已无法满足临床需求,但高通量测序由于成本价格较高仍无法在实验室中广泛应用。临床上可根据听力筛查结果、表型情况或家族遗传性分层次制定不同检测方案,可以先用基因芯片技术或MALDI-TOF MS进行初筛,再结合听力测试结果或表型情况,进一步选择成本相对低的WES进行检测。如WES还不能明确致病基因,可以选取WGS进行补充。分层次检测能够为患者提供更优的检测策略、提高诊断率并节约成本。未来,相信NGS会更优化,新生儿的耳聋检测与预防必将进入新的时代。