健脾益肾方对痛风性肾损害患者尿液微RNA表达变化的研究

陈坚翱，罗恒，胡艳艳，徐红

健脾益肾方对痛风性肾损害患者尿液微RNA表达变化的研究

陈坚翱1，罗恒2，胡艳艳1，徐红1

1.杭州市中医院科教部，浙江杭州 310007；2.杭州市富阳区中医院神经内科，浙江杭州 311400

分析健脾益肾方干预前后痛风性肾损害患者尿液微RNA（microRNA，miRNA）的表达变化。通过高通量测序法检测早期痛风性肾损害患者干预前后尿液外泌体源性miRNA的表达谱，并比较表达变化情况。早期痛风性肾损害患者与正常人群的尿液外泌体源性miRNA有明显差异；早期痛风性肾损害患者健脾益肾方中药干预后，19个可作为生物标记物的miRNA中有5个平均表达值上调，14个平均表达值下调。健脾益肾方对痛风性肾损害患者的miRNA表达有一定调节作用，差异表达的miRNA可能参与肾损害的发生发展。

痛风性肾损害；微RNA；健脾益肾方

痛风性肾病是由血尿酸产生过多和（或）排泄减少形成高尿酸血症所致的肾损害。随着我国居民生活水平的提高，痛风性肾病发病率呈上升趋势，我国的痛风患病率为0.34%～2.84%，临床上5%～15%的高尿酸血症患者发展为痛风[1]。而沿海地区由于饮食等因素，痛风及高尿酸血症的发病率相对更高一些。目前高尿酸血症的干预率低，痛风缺乏规范性治疗，约1/3的痛风患者可出现肾脏病变并最终进展为终末期肾病[2]。以肾脏功能为焦点的健康管理已逐渐进入大众视野，引起社会广泛关注，未病先防、已病防传、既病防变、瘥后防复的中医“治未病”思想俨然成为早期防治的重要组成部分。早期诊断痛风性肾病对保护肾功能、改善预后有重要意义。微RNA（microRNA，miRNA）是长度为18～25个核苷酸的非编码RNA，通过转录后与信使RNA的特定位点结合来调控靶基因的表达。研究显示，差异表达的miRNA可通过炎症反应、肾脏血管内皮细胞功能障碍、肾脏血管再生及修复和氧化应激等途径影响肾损伤的进展[3-6]。尿液外泌体中的miRNA比尿液细胞中的更加稳定，包含来自肾小球、肾小管、膀胱等泌尿系统细胞的生物学信息，且提取方便[7-8]。通过前期实验研究，课题组筛选出19个在早期痛风性肾损害患者中表达差异的miRNA。基于此，本研究拟探讨中药干预前后痛风性肾损害患者上述miRNA的变化情况。

1 资料与方法

1.1 研究对象

选取2016年7月至2018年3月就诊于杭州市中医院的早期痛风性肾损害患者5例。纳入标准：①年龄18～65岁；②符合《内科学》[1]中痛风及痛风性肾病的诊断标准；③104μmol/L<血肌酐<200μmol/L；④中医辨证符合脾肾两虚证。排除标准：①有导致高尿酸血症的继发性疾病；②服用降脂、布美他尼等药物引起的血尿酸增高者；③患有严重心、脑、肺、血液系统疾病及其他可能导致肾功能不全等疾病者；④近3个月有生育计划者，妊娠期或哺乳期女性；⑤患有精神疾病者；⑥既往对中药过敏者，或不能耐受口服中药者；⑦正在参与其他临床研究者；⑧研究人员认为不适合参加的其他情况。另选取体检中心的健康人群5名。所有研究对象均自愿参与并签署知情同意书，本研究经杭州市中医院伦理委员会批准（伦理审批号：2016KY048）。

1.2 主要实验试剂及仪器

乙酸、乙醇、异丙醇、氯仿购自生工生物工程（上海）股份有限公司，糖原、TRIzol LS试剂购自Invitrogent Corporation，DEPC水购自Sigma Corporation，苯甲基磺酰氟、亮抑酶肽、二硫基苏糖醇购自Biosharp Corporation，磷酸盐缓冲液购自吉诺生物医药技术有限公司。生物分析仪、测序仪、快速SR富集试剂盒、快速SBS试剂盒购自Illumina Corporation，PCR试剂盒购自Qiagen Corporation。–20℃低温冰箱、–80℃超低温冰箱、制冰机、电子天平、超净工作台、超速离心瓶、超速离心机、台式离心机、量程移液枪及枪头、EP管、全波长紫外/可见光扫描分光光度计、恒温水浴箱。

1.3 药物准备

健脾益肾方组成：黄芪15g，土茯苓30g，桑寄生15g，淫羊藿10g，丹参15g，秦艽10g，豨莶草10g，女贞子15g，当归12g。水煎取药汁200ml，每日1剂，分2次服用。

1.4 研究方法

分别收集所有研究对象入组时及早期痛风性肾损害患者中药干预3个月后的中段尿，差速离心法收集尿液中的外泌体，TRIzol法提取总RNA。将提取的RNA使用高通量测序检测miRNA表达谱，比对19个可作为生物标记物的miRNA在早期痛风性肾损害中药干预前后的表达变化。

1.4.1 尿液收集 尿液收集前一日22时后停止进食、饮水，留取次日清晨第一次小便的中段尿液。使用2个100ml无菌离心管收集尿液，每管70ml，编号后置于低温环境待测。

1.4.2 尿液外泌体分离 将42μl 0.001mol/L的亮抑酶肽和350μl 0.1mol/L的苯甲基磺酰氟滴入装有70ml尿液样本的离心管中，缓缓摇匀；4℃ 17 000×g的转速下离心0.5h；收集上清液，4℃ 200 000×g的转速下离心1h；去除上清液，留取管底沉淀物，加入56μl 0.01mol/L的磷酸盐缓冲液后摇匀，加入已编好序号的EP管，最后滴入56μl 60mg/ml的二硫基苏糖醇缓冲液；EP管浸入60℃恒温水箱中加热10min；–80℃冰箱保存，以备后续操作使用。

1.4.3 样本总RNA的提取、质控 使用TRIzol法提取外泌体中的总RNA，用NanoDrop®ND-1000测定样本总RNA浓度和纯度。

1.4.4 制备miRNA测序文库 在每个样本总RNA的5’及3’端加入RNA接头，运用Illumina RT引物和扩增引物进行反转录扩增，合成cDNA，再用PCR扩增。再从PAGE胶上选出135～155bp的PCR扩增片段，同时用QIAquick PCR Purification Kit进行纯化。最后运用Agilent 2100 Bioanalyzer定量文库。将样本滴定到最后的浓度8pmol/L，再用TruSeq Rapid SR cluster Kit（GD-402-4001）在Illumina cBot上进行簇生成。

1.4.5 上机测序 运用TruSeq Rapid SBS Kit（FC-402-4002），在Illumina NextSeq 500测序仪上开展50个周期的测序。

1.5 统计学方法

运用STEM软件统计分析miRNA的表达趋势。以正常人群miRNA的平均表达值为基准，经STEM软件转换为0，将中药干预前、后的平均表达值进行比较，判断表达的上调或下调。

2 结果

2.1 样本总RNA和文库质检结果

2.1.1 总RNA浓度和纯度检测结果 用NanoDrop®ND-1000检测尿液外泌体总RNA的OD值，结果显示OD260/OD280为1.33～1.68，OD260/OD230为0.69～1.61。说明RNA纯度可，杂质含量较少，经上机前检验，各项检测参数均基本满足后续miRNA测序实验要求。

2.1.2 测序文库质控结果 利用Agilent 2100 Bioanalyzer，使用Agilent DNA 1000 chip kit测定测序文库质量，文库长度为142～146bp。

2.1.3 miRNA数据质量评估 将样本中的片段去接头后，长度在16～30nt的片段主要集中在22nt左右，说明后续miRNA测序结果质量可靠。

2.2 miRNA的时间序列基因表达趋势

运用STEM软件分析发现，早期痛风性肾损害患者与正常人群的尿液外泌体源性miRNA有明显差异；早期痛风性肾损害患者中药干预后19个可作为生物标记物的miRNA中平均表达值上调5个，平均表达值下调14个，见表1。

3 讨论

痛风性肾病的损害是多方面的，一旦出现严重的肾损害，会给患者、家庭和社会带来沉重的负担。祖国医学未曾有“痛风性肾病”的病名记载，现根据其主要临床表现可归属为尿浊、石淋、肾水等范畴。《诸病源候论·石淋候》记载“石淋者，淋而出石也”。故尿酸性结石及血尿者可归为石淋、血淋；若有蛋白尿者，可归于尿浊、膏淋；出现肾功能不全者，可归为水肿、肾水等。中医学认为，患者禀赋不足、脾肾亏虚是疾病发生的内因，感受六淫邪气、饮食不节是疾病发生的外因[9-12]。故本病的病机多属脾肾亏虚，夹湿、夹瘀阻滞经络所致。

痛风性肾病是痛风发展到后期出现的病症，其中医辨证虽与痹证有相似之处，但亦有不同。黄勇等[13]认为在高尿酸血症时即可祛除湿、痰、瘀，调节气血阴阳，阻断疾病进展，为“治未病”范畴，正如《丹溪心法》所云“与其救疗于有疾之后，不若摄养于无疾之先”。若发展至肾脏损害时，根据四诊辨证分型，各中医学者观点又有所不同。刘旭生将痛风性肾病分为急性期、好转期、缓解期，分别使用桃红四物汤合四妙汤加减、济生肾气丸合参苓白术散加减、温脾汤合真武汤加减予以治疗[14]。丁颖迪[15]在结合临床经验的基础上将痛风性肾病分为脾肾虚衰、湿毒内滞，气阴两虚、水湿内停，湿热痹阻、瘀血内停等证。以上诸证在临床诊治中可单独出现，也可相互夹杂。

本研究的健脾益肾方由经验方“芪苓颗粒/尿酸利仙方”化裁而来。课题组前期研究发现“芪苓颗粒/尿酸利仙方”可有效治疗高尿酸血症、痛风、痛风性肾病等，疗效确切[16-19]。本方证因脾肾两虚日久，湿瘀互结于肾，以致肾失封藏，精微物质外泄。本病多属邪实正虚，邪实宜攻，正虚宜补，故当健脾祛湿、益肾化瘀。方中以黄芪益气健脾，脾健则水湿得化。土茯苓、豨莶草利水渗湿，使湿邪外出有路。桑寄生、女贞子、淫羊藿补益肾脏，肾元充则精微藏。丹参、当归活血化瘀，佐以秦艽化湿通络，使湿瘀开解。诸药合用，既能健脾益肾，又可清热利湿、化瘀泄浊，使正气得复，邪气自去。

本研究发现，与干预前比较，中药干预后19个可作为生物标记物的miRNA有5个平均表达值上调（hsa-miR-5100、hsa-miR-4454、hsa-miR-4286、hsa-miR-1260a、hsa-miR-1260b），其余14个均下调。miRNA是基因表达负调控因子，最早在秀丽隐杆线虫的lin-4和let-7中发现，可通过靶向结合信使RNA的特定位点调控靶基因的表达。每个miRNA可有几十甚至几百个靶基因，而多个miRNA也可共同调节一个靶基因，从而在miRNA和靶基因间构成复杂的调控网络。迄今为止，人类基因组已测定的miRNA远超过2000种。miRNA具有高度保守性、时序性和组织特异性等特点，在不同的物种之间有一定的价值。miRNA涉及动物、植物和真菌等生物的广泛生物过程，并发挥重要作用。失调的miRNA表达与多种人类疾病相关，其还参与肿瘤、内分泌等疾病的发生发展[20-21]。

表1 miRNA的平均表达值（STEM软件转换后）

注：A正常人群，B早期痛风性肾损害患者中药干预前，C早期痛风性肾损害患者中药干预后

运用健脾益肾方对痛风性肾损害患者进行干预，对miRNA表达变化具有一定的调节作用，其中表达上调的5个miRNA中，hsa-miR-5100可能与肾损伤的系统性红斑狼疮相关，hsa-miR-1260a可能与狼疮性肾炎、巴尔干地方性肾病相关，hsa-miR-1260b可能与Ⅳ级狼疮性肾炎相关[22]。但miR-4454、miR-4286的相关研究较少，特别是在肾脏疾病方面，仍有很大的挖掘潜力，有待深入研究。本研究发现的差异性miRNA暂未证实与痛风性肾损害有直接关联，有待今后多中心、大样本研究进一步论证。通过生物信息学挖掘和潜在调控机制分析，可为痛风性肾损害发病的机制研究提供新依据，对保护肾功能的临床治疗提供早期预警标识，为中药疗效评价及中药研发提供新思路。

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Study on the changes of urinary microRNA expression of Jianpi Yishen decoction in patients with gout renal damage

CHEN Jian’ao, LUO Heng, HU Yanyan, XU Hong

1.Department of Science and Education, Hangzhou Hospital of Traditional Chinese Medicine, Hangzhou 310007, Zhejiang, China; 2.Department of Neurology, Hangzhou Fuyang Hospital of Traditional Chinese Medicine, Hangzhou 311400, Zhejiang, China

To analyze the changes of microRNA (miRNA) expression in urine of patients with gout renal damage before and after the intervention of Jianpi Yishen decoction.The expression profiles of urine exosome-derived miRNAs were detected by high-throughput sequencing before and after intervention in patients with early gout renal damage, and the expression changes were compared.Urine exosome-derived miRNAs were significantly different between the patients with early gout renal damage and the normal population. After the intervention of Jianpi Yishhen decoction, the expression of 19 miRNAs that could be used as biomarkers were up-regulated in 5 and down-regulated in 14.Jianpi Yishen decoction can regulate the expression of miRNA in patients with gout renal damage to some extent, and differentially expressed miRNA may be involved in the occurrence and development of renal damage.

Gout renal damage; MicroRNA; Jianpi Yishen decoction

R589.7

A

10.3969/j.issn.1673-9701.2023.22.019

浙江省科技计划项目（2017C33196）

陈坚翱，电子信箱：280185808@qq.com

（2022–10–13）

（2023–07–05）