基因修饰骨组织工程技术研究进展

许杰男 乔永杰 邹庆芳 马东洋

骨组织工程技术的三大要素为生物支架、种子细胞和生长因子，其中生长因子的应用方式主要为重组蛋白和基因修饰。重组蛋白应用是将成骨相关蛋白与支架复合后植入体内，其操作简单，不足之处在于价格昂贵且生物半衰期短，通常需要大剂量应用以维持长时间的作用，且超剂量外源性蛋白可导致异位成骨、毒性反应，甚至癌症的发生[1]。基因修饰骨组织工程（GMBTE）是将目的基因导入种子细胞内，利用细胞作为生长因子的发生器，使生长因子持续稳定地表达，此方式有望实现有效浓度下生长因子的持续局部表达[2]。由于可克服局部应用重组蛋白的缺点，GMBTE 在骨缺损修复重建治疗中展现出良好的应用前景。

本文围绕GMBTE 目的基因选择、载体选择以及基因投递方式进行综述，旨在为GMBTE 的转化应用提供理论基础。

1 目的基因选择

GMBTE 目的基因一般为表达生长因子的基因或调控生长因子表达的基因，靶基因通过表达生长因子来调控细胞的增殖、分化和基质分泌。

1.1 表达生长因子的基因

GMBTE 靶基因表达的生长因子包括骨形态发生蛋白（BMP）、血管内皮生长因子（VEGF）、转化生长因子（TGF）- 和成纤维细胞生长因子（FGF）等。BMP 属于TGF- 超家族的分泌信号因子，在骨修复再生的所有阶段都发挥至关重要的作用，其中BMP-2、BMP-4、BMP-6、BMP-7 和BMP-9 的成骨能力较强[3]。VEGF 是功能最强大的促血管生成发育的生长因子，也可以通过趋化和促进成骨细胞分化来加速骨愈合[4]。上述生长因子基因以互补DNA（cDNA）或化学修饰信使RNA（mRNA）的形式应用于GMBTE 中，可在不同程度上提高骨缺损的治疗效果。

此外，多基因联合修饰拥有良好的协同作用，可在体内显著提高骨修复作用。负载共表达BMP-2 和FGF-2 的胶原支架可通过激活Smad 信号通路和细胞外信号调控激酶（ERK）信号通路，共同促进Runt 相关转录因子2(Runx2)转录以增强成骨[5]。BMP 和VEGF 分别是骨生成和血管生成的关键调节因子，BMP-2和VEGF双基因递送支架可显著促进血管化骨再生[6]。多基因修饰存在一定局限性，需进一步研究不同基因比例对骨缺损修复效果的影响。

1.2 调控生长因子表达的基因

调控生长因子表达的基因应用于骨组织工程技术时，可作为调控因子来调节多种生长因子的表达，主要包括转录因子Runx2[7]与Osterix（Osx）、低氧诱导因子(HIF)、信号素3A[8]、含LIM 结构域、半胱氨酸富集蛋白1[9]和微RNA (miRNA)等。Runx2 是BMP 信号通路下游端的转录因子，其过表达可上调非成骨细胞中多个成骨细胞特异性基因的表达；而Osx 是一种含锌指转录因子，作用于Runx2 信号通路下游。Runx2 和Osx 对成骨细胞分化和骨形成均至关重要。HIF 可启动血管生成-成骨级联反应，当机体缺氧时，HIF 作为上游调节因子可激活包括TGF-β、血管生成素1、干细胞因子和胎盘生长因子等数百个靶基因的转录[10]。miRNA 是小型非编码RNA，其发挥作用的机制尚不明确，可能是通过抑制特定mRNA 来调节各种生物过程。众多研究表明，miRNA 在成骨分化和骨再生中发挥重要作用[11-12]，是当前GMBTE 中靶基因研究的热点。

2 构建载体选择

GMBTE 技术需要将靶基因导入种子细胞并在较高水平持续表达一段时间，为了携带基因以及保护基因免受核酸酶和基因负电荷的影响，外源基因进入靶细胞通常需要借助载体。

2.1 病毒载体

病毒载体是将病毒的致病基因去除，保留其成骨或成血管基因。常见的病毒载体包括腺病毒（Ad）载体、逆转录病毒（RV）载体、慢病毒(LV)载体和腺相关病毒(AAV)载体等。Ad 载体的基因转染效率和表达水平较高，是最早应用于基因修饰的载体之一[13]。Ad 载体介导BMP[14-17]和HIF-1α[10]等基因可成功转入种子细胞并获得包括目的基因、相关mRNA 和蛋白质的高表达。Ad 载体携带的基因组游离于宿主基因组外独立表达，体内表达时间只有6 周左右，但足以诱导骨形成级联反应，并可避免长期分泌蛋白产生的不良反应。RV载体可将外源基因整合到细胞，实现靶基因永久的高水平表达，宿主细胞后代也可持续表达靶基因[18]。LV 是一种能够感染分裂和非分裂细胞的特殊逆转录病毒[19]。通过LV 载体可将 防御素3 和结缔组织生长因子成功转染入靶细胞，其转染效率稳定，并可获得目的基因的高表达[20]。AAV 载体携带的基因不会整合到宿主基因组，即使在高载体剂量下，其介导的基因转染也是相当安全的。但是，AAV 载体的制造成本高且纯度较低，若能克服这些缺点，其可成为GMBTE 最理想的载体。

病毒载体通常有进入细胞的自然倾向，因具有高转染效率成为GMBTE 中最常见的选择，但其安全问题应引起重视，如Ad 载体可引起宿主强烈的免疫反应和毒性反应[21]，RV 载体有激活细胞原癌基因而引发肿瘤的可能[18]，LV 载体也被报道可引起造血干细胞的恶性克隆扩增[22]。为了提高载体安全性，学者们采用消除载体中的病毒基因并使用特异性启动子减少细胞反应的方法[23]。近期，Bougioukli 等[24]将激活线粒体凋亡途径的诱导型半胱天冬酶9 基因插入LV-BMP-2 中，二聚化的化学诱导剂激活后可选择性地诱导转基因细胞凋亡，阻断骨形成。这种“自杀”式时空调控，可降低基因修饰相关不良反应和载体诱变基因突变的发生可能。

2.2 非病毒载体

非病毒载体具有制备简单、免疫原性低和毒性低的优点，通常可分为物理载体和化学载体。

2.2.1 非病毒化学载体

非病毒化学载体一般由基因与聚合物、脂质体或无机纳米粒子等组合而成。

聚乙烯亚胺(PEI)及其衍生物是体内和体外都有效的转染剂，被广泛应用于 GMBTE 中。PEI 是一种强大的阳离子聚合物，可通过“质子海绵”效应，促进基因内小体逃逸及DNA 转移到细胞核，被作为评价其他非病毒载体的“金标准”，但PEI 会破坏细胞膜而引起细胞毒性。近期的一项研究发现，高钙浓度下可溶性PEI 相互聚集，从而减少了破坏细胞膜的游离PEI，降低了PEI 的细胞毒性；同时，钙离子浓度为10 mmol/L 时可增强“质子海绵”效应，提高PEI 转染效率[25]。

脂质体可与细胞膜相融合，介导基因进入细胞内部。Nishikawa 等[26]对比了脂质体-质粒DNA、脂质体-RNA 和RV-DNA 3 种转染方式，发现脂质体-RNA 与RV-DNA 的转染效率相当，但脂质体-RNA 转染的基因表达时间更早，表达细胞数更多。脂质体-RNA 转染具有与病毒载体转染相当的转染效率，具有较高的安全性，同时其对目的基因片段大小和靶细胞生理状态的限制较低，是一种简单快捷的转染方式。

2.2.2 非病毒物理载体

非病毒物理载体技术主要包括基因枪法、声穿孔法、电穿孔法和磁转染法等。

基因枪法又称生物弹道技术或微粒轰击技术，其利用微粒加速装置，将载有基因的重金属元素颗粒打入细胞或组织。声穿孔法和电穿孔法可提高细胞膜渗透性，以增加基因进入细胞的效率。Kawai 等[1]将BMP-2/7基因通过电穿孔法转移到大鼠牙周组织中，于转染后第3 天检测到2 种基因的表达，第5 天检测到牙槽部位的新骨形成。电穿孔法和声穿孔法作为物理载体转染细胞已经得到广泛研究，两种方法各有优缺点，电穿孔法的转染效率更高且更为稳定，而声穿孔法对组织细胞的侵入性小，更为安全。

近年来，肽修饰物因穿过细胞膜能力强被广泛用于药物递送系统的研究中，其可负载多种大分子物质进入细胞而发挥作用，肽修饰的非病毒载体[6,12,27]和病毒载体[28]等新型载体同样在GMBTE 中展现出巨大潜力。细胞穿透肽是一类较小的短多肽序列，具有高穿透活性和稳定性的优点，为GMBTE 更安全地应用提供了可能性[29]。

未来的载体开发将不断优化病毒载体的安全性和非病毒载体的转染效率，理想载体应为高转染效率、低毒性和无免疫原性的合理统一。

3 基因投递方式

GMBTE 的核心问题是如何将基因载体导入宿主骨缺损部位进行过表达，按其投递方式可分为体内基因投递和体外基因投递。

3.1 体内基因投递

体内基因投递是将基因载体直接注射入宿主体内。此方式操作简单、成本低廉，并可避免因采集自体细胞引起的相关并发症。Betz 等[30]开展研究将Ad-BMP-2 经皮注射到病灶内，发现可在8 周内诱导大鼠5 mm 股骨缺损愈合，修复组织是以骨小梁为主的矿化骨。Ishihara 等[31]对直接注射Ad-BMP-2 与细胞介导的Ad-BMP-2 两种方式治疗马肋骨骨缺损进行比较研究，发现细胞介导组能更有效地促进骨生成，这可能是因为细胞介导组拥有较高的转染效率，且可增加骨缺损部位的细胞密度，而这些显然是直接注射基因载体复合物所欠缺的。直接注射法还存在基因载体从植入部位扩散而造成异位骨化或安全隐患的问题。

为了避免或减轻基因和载体的异位扩散，可将载体附着在基因活化基质(GAM)上来完成体内基因投递。GAM 可保护基因免受细胞外屏障的攻击，包括免疫系统的攻击和血清核酸酶或蛋白酶的降解。Zhang 等[32]开发了一种高度稳定、无毒性作用且编码BMP-2 的化学修饰RNA（cmRNA），当将其加载到胶原海绵中时可持续释放cmRNA。他们开展的体内研究证明，cmRNA 组骨缺损区拥有更成熟的骨结构，且存在软骨内骨化过程。有学者对BMP-2质粒投递方式采用GAM 形式还是细胞介导进行研究，发现在基因投递过程中，目的基因的产生量及产生时间对骨形成的作用比靶细胞的存在更为重要[33]，因此细胞接种或许不是转基因表达的必要条件。

体内基因投递的发展仍需克服很多障碍，因为宿主特定解剖部位的细胞种类较多，基因转染入靶细胞的难度较大，故此方式的转染效率低且存在基因异位表达的风险。此外，体内基因投递需要受损部位的细胞数量充足，故不适用于大段骨缺损和大面积软组织缺损的情况。

3.2 体外基因投递

3.2.1 常规体外基因投递

GMBTE 中的常规体外基因投递是在体外将基因载体转染入靶细胞，再将转基因细胞扩增后植入宿主体内。由于可对转基因细胞进行选择和测试，故此方式转染效率高、可控性强且相对安全，是最常用的基因投递方式。

Fan 等[34]研究发现，BMP-2 转染骨髓间充质干细胞（BMSC）可促进细胞的成骨分化作用，并分泌更多含钙离子成分的细胞外基质；在体内实验中，转染基因组的炎性细胞明显减少，支架消失，且血管生成。常规体外基因投递需要进行2 次手术和侵入性细胞采集，并需要在良好的生产规范设施下培养和扩增细胞，这些步骤增加了成本和时间，且细胞特性发生变化和植入污染的风险也较高。

3.2.2 快速体外基因投递

为了克服常规体外基因投递的缺点，学者们开发了快速体外基因投递方式。

快速体外基因投递是将基因转染于组织而非单一的特定细胞，转基因组织为可生物降解的肌肉碎片[35]、脂肪碎片[36]、骨髓细胞[37]等，此方法因无需进行细胞的分离、培养、扩增，而使时间和成本均明显减少。Virk 等[38]开发了一种“当日”快速体外基因投递技术，即组织碎片的获取、转染和重新植入在1 次手术中完成。他们将大鼠骨髓细胞和LV-BMP-2 共培养1 h 后回植到大鼠骨缺损处，手术时间小于3 h。“当日”组手术后8 周时，骨缺损完全愈合，与传统组相比，其骨愈合时间更早，新生骨体积更大。与此不同，Bougioukli 等[37]分别采用快速体外基因投递法与常规体外基因投递法治疗裸鼠临界骨缺损，发现传统“两步”组（采用常规体外基因投递法）拥有更高的愈合率和新生骨质量。这可能是因为培养后的骨髓细胞与新鲜分离的骨髓细胞体内存活情况、转基因表达水平和持续时间不尽相同。

快速体外基因投递法可能在较大的骨缺损治疗中失败，而失败的代价往往是截肢，所以快速体外基因投递法有必要进一步完善。

4 展望

尽管GMBTE 已取得诸多进展，但尚未真正应用于临床，基因修饰可能带来的不良反应尚需要进一步优化。编码生长因子基因的单独应用或联合应用已经取得众多研究成果，miRNA 作为新的治疗靶点展现出巨大潜力，但其骨再生作用的相关机制还需要进一步研究。载体的选择多种多样，各有优劣，而新型载体（如细胞穿透肽）的研究刚刚起步，有望成为GMBTE 中最理想的载体。纵观基因导入细胞方式，从早期的基因载体直接皮下注射，到近年来基因载体复合支架或GAM 方式，GMBTE 技术逐渐成熟并在骨缺损治疗中取得良好效果，而快速基因投递为GMBTE 提供了新思路。未来GMBTE 技术靶基因的选择需要针对疾病发病机制进行个性化选择，载体构建和基因投递方式需要兼顾安全性和转染效率。

骨组织形成是复杂的级联事件，涉及受损部位多因子的时间依赖性表达，因此基因表达的时间、空间和水平调控变得尤为重要。生物支架和GAM的设计应模拟自然骨再生过程以促进骨组织再生。此外，时空调控还可通过基因开关系统如上述的“自杀式”时空调控系统来实现。随着GMBTE 研究的进展，其有望应用于临床，为骨缺损修复重建带来新的希望。