miR-488靶向NRSN2介导NF-κB信号通路在骨肉瘤增殖和侵袭中的作用

麦麦提艾力·阿不力克木 艾克白尔·吐逊 梁志林 阿力木·克热木

骨肉瘤多发于儿童和青少年,占儿童癌症的3%～5%和成人癌症的1%,是临床最常见的骨骼系统原发性恶性肿瘤[1]。虽然新辅助化疗的出现使患者的5年生存率有极大地提高,保肢术也逐渐取代截肢术,但相关研究显示,骨肉瘤仍是一种病死率及致残率极高的肿瘤[2]。随着对骨肉瘤认识的不断深入,骨肉瘤的靶向治疗也越来越多的成为研究的重点,探索新的骨肉瘤的生物标志物与治疗靶点对于骨肉瘤的治疗至关重要。环状小RNA(microRNA,miRNA)是一种内源性高保守的非编码小分子RNA,长度为18～24个核苷酸,可在翻译水平上调控基因表达[3]。miRNA可以通过精确调节基因表达而广泛调节细胞的生长、增殖、分化、代谢以及死亡等过程[4]。据报道,在骨肉瘤中存在miRNA的异常表达,表明miRNA可能参与骨肉瘤的发病机制[5]。miR-488是miRNA的一种,根据相关研究,miR-488在骨肉瘤细胞中的表达较低,如果过度表达,会抑制骨肉瘤细胞的迁移、侵袭和上皮间质转化[6]。神经膜蛋白2(neurensin 2,NRSN2)是一种特异性的表达于脊椎动物中枢神经细胞的膜蛋白,存在于神经元囊泡中,由202个氨基酸构成,分子量为28 kDa[7]。Ma等[8]研究表明NRSN2能够加速肝癌细胞的凋亡和衰老,结果证实NRSN2可能是肝癌的肿瘤抑制基因和长期生存的候选生物标志物。但是NRSN2与骨肉瘤的关系尚缺乏相关研究,NRSN2是否通过与miRNA相互作用调节骨肉瘤的发展也有待进一步研究。本实验基于miRNA调控网络,探讨miRNA在骨肉瘤发展中的作用,通过miRNA-seq寻找正常癌组织与癌旁组织中的差异miRNA,并研究其与NRSN2的作用机制,为将来研究骨肉瘤的免疫疗法提供参考价值。

1 材料与方法

1.1 一般资料 选取2019年1月至2022年2月我院治疗的骨肉瘤患者(32例)的肿瘤及其癌旁组织。排除标准:(1)术前接受放、化治疗;(2)有糖尿病和心脑血管疾病。本研究经医院伦理委员会批准,并取得患者知情同意。

1.2 细胞与主要试剂 MG63骨髓瘤细胞系购自中科院上海细胞库;IKK-16(CAS 编号:873225-46-8)购自上海羽朵生物科技有限公司;TRizol购自上海翌圣生物科技股份有限公司; RPMI-1640培养基、胰酶消化液购自武汉普诺赛生命科技有限公司;胎牛血清购自美国Gibco公司;Firefly Renilla萤光素酶试剂盒和荧光素酶报告载体购自美国Promega公司;PrimeScript RT Kits逆转录试剂盒、LipofectamineTM 2000、si-NC、si-miR-488购自美国Invitrogen公司;SYBR Green SuperMix 购自上海罗氏制药有限公司;GAPDH、NRSN2 和miR-488由上海生工生物工程有限公司合成;Transwell小室购自上海玉博生物科技有限公司;NRSN2抗体、NF-κB(p65)抗体、GAPDH抗体与荧光标记的二抗均购自英国abcam公司;CCK8试剂、4%多聚甲醛和结晶紫购自北京索莱宝科技有限公司;RIPA裂解缓冲液、5% 脱脂牛奶和增强型ECL发光液购自北京普利莱基因技术有限公司。

1.3 方法

1.3.1 miRNA-seq:TRizol法提取骨肉瘤患者肿瘤组织和癌旁组织的总RNA,交给华大基因公司进行miRNA-seq。步骤如下:使用NEXTFLEX Small RNA-Seq Kit v3将400 ng RNA进行16个PCR循环,随机制备成Small RNA-seq文库。测序文库在 Illumina 的 NextSeq 500 系统上进行测序,并捕获50 bp单端读数。以 miRBase 20.0为参考,mirdeep2和 srna-tools-cli软件用于获取潜在miRNA并绘制二级结构[9]。使用 Benjamini &Hochberg方法调整P值。默认情况下,将校正的P值0.05 设置为显著差异表达的阈值。

1.3.2 细胞培养及传代:使用RPMI-1640培养基(含10%胎牛血清与青链霉素混合双抗)培养MG63骨肉瘤细胞,于37℃,5%CO2细胞培养箱中进行培养。当细胞密度达80%～90%时,弃去培养上清,PBS润洗细胞1～2次,采用胰酶消化液进行消化,培养基终止消化,在1 000 r/min条件下离心4 min,弃去上清液,培养基重悬后传代培养。

1.3.3 调控mRNA 的靶miRNA预测:使用在线工具ENCORI(https://starbase.sysu.edu.cn/)预测靶向NRSN2基因的miRNA。ENCORI 是一个开源平台,可以从CLIP-seq、degradome-seq 和 RNA-RNA 相互作用组数据中研究 miRNA-ncRNA、miRNA-mRNA等的相互作用。本研究使用了其中2个功能模块。“miRNA-Target”和“Pan-Cancer”。其中“miRNA-Target”平台可以通过所有7个miRNA预测数据库(PITA、RNA22、miRmap、microT、miRanda、PicTar、TargetScan)通过基因的mRNA预测miRNA;“Pan-Cancer”平台的数据来源于TCGA数据库中的32种癌症类型。通过TargetScan数据库(http://www.targetscan.org/vert_71/)用于预测NRSN2基因与miR-488结合位点。

1.3.4 细胞转染和分组:将MG63细胞分为si-NC组、si-miR-488组。按照LipofectamineTM2000说明书步骤进行转染。调整MG63数量并接种于6孔板,使用不含抗生素的完全培养基培养,使转染时细胞达70%左右生长密度。制备si-miR-488与脂质体的复合物,同时制备无干扰作用的si-RNA (si-NC) 与脂质体复合物,将复合物加入6孔板相应si-NC组、si-miR-488组的孔内,摇动混合,5～6 h将细胞培养基倒掉,PBS洗涤细胞2次,更换为RPMI 1640培养基,48 h后进行后续实验操作。IKK-16共孵育条件为50 nmol/L,12 h。分为si-NC组、si-miR-488组和si-miR-488+IKK-16组(转染si-miR-488后给予IKK-16共孵育)。

1.3.5 双荧光素酶报告基因实验:双荧光素酶活性检测试剂盒(Dual-Luciferase Assay System Kit)检测双荧光素受体基因。扩增后,将突变型和野生型NRSN2的3’UTR插入荧光素酶报告载体(pmirGLO),并将miR-NC/miR-488模拟物与荧光素酶质粒共转染到MG63细胞。48 h后,以海肾荧光素酶活性为标准物,用Firefly Renilla萤光素酶试剂盒测量萤光素酶活性。

1.3.6 qRT-PCR检测miR-488和NRSN2表达:使用TRIzol收集总细胞和组织 RNA,然后以 PrimeScript RT Kits逆转录试剂盒将RNA制备成 cDNA。再以Mx3000P 实时PCR系统 (Thermo Fisher)检测。PCR条件如下图所示,94℃ 15 s,60℃ 10 s,72℃ 20 s,共40个循环。随后,采用2-ΔΔCt方法进行数据分析,其中 GAPDH为内部参考。引物序列:GAPDH-F,5-AATGGGCAGCCGTTAGGAAA-3,GAPDH-R,5-GCGCCCAATACGACCAAATC-3;NRSN2-F,5-GGAAAAGGACGCAGTTGGTG-3,NRSN2-R,5-CACTGCATAGCCAGTGGTCA-3;miR-488-F,5-TTCGGGTGAGAGTGAGAATCC-3,miR-488-R,5-GTCTTCTGACCAAGAAACAGCC-3。

1.3.7 CCK8检测细胞增殖:用细胞计数板对各组细胞进行计数(1×104)后,接种于96孔细胞培养板中,分别在24 h、48 h、72 h时加入10 μl CCK8溶液,37℃继续培养2 h,酶标仪检测450 nmol/L的光密度(OD)值,以OD值作为细胞的相对增殖水平。

1.3.8 Transwell侵袭试验:取各组细胞,胰酶消化后离心,后用无血清RPMI 1640培养基重悬细胞并计数,调整细胞数至2×104个/ml,将细胞铺板至涂有基质胶的上Transwell小室中。培养箱中培养24 h后,将小室中的细胞用4%多聚甲醛固定、结晶紫染色并在显微镜下观察,随机选取10个视野进行计数。

1.3.9 Western blot检测NRSN2和NF-κB(p65)蛋白表达:使用RIPA裂解缓冲液提取细胞蛋白,然后进行12% SDS-PAGE以分离提取的蛋白质,转移到 PVDF膜上,使用 5%脱脂牛奶封闭膜,并分别与一抗溶液在4℃下孵育过夜,包括NRSN2抗体(稀释比1∶1 000)、NF-κB(p65)抗体(稀释比1∶1 000)、GAPDH抗体(稀释比1∶5 000)。之后,使用二抗 HRP 标记的兔 IgG(1∶5 000) 进一步孵育条带。采用增强型ECL发光液进行蛋白质可视化,Image-Pro Plus图像分析系统对蛋白条带的灰度值进行分析。

2 结果

2.1 骨肉瘤组织与癌旁组织中NRSN2及miR-488表达比较 qRT-PCR结果显示,与癌旁组织比较,肿瘤组织NRSN2 mRNA表达水平升高。根据肿瘤组织NRSN2表达水平的前1/3和后1/3,分为NRSN2高表达和NRSN2低表达肿瘤组织。miRNA-seq结果显示,与NRSN2低表达肿瘤组织比较,NRSN2高表达肿瘤组织中有276个miRNA表达升高,294个miRNA表达降低,其中miR-488降低显著。qRT-PCR结果显示,与癌旁组织比较,肿瘤组织miR-488 mRNA表达水平降低(P<0.01)。Spearman相关系数分析结果显示,miR-488表达与NRSN2表达呈负相关(R=0.4019,P<0.05)。见表1,图1。

图1 癌旁组织和肿瘤组织差异miRNA比较;A miRNA-seq检测癌旁组织和肿瘤组织差异miRNA;B Spearman分析miR-488和NRSN2相关性

表1 癌旁组织和肿瘤组织NRSN2和miR-488表达比较

2.2 沉默miR-488抑制NRSN2和NF-κB信号通路 qRT-PCR结果显示,与si-NC组比较,si-miR-488组miR-488 mRNA表达水平降低,NRSN2 mRNA表达水平升高(P<0.05)。Western blot结果显示,与si-NC组比较,si-miR-488组NRSN2和NF-κB(p65)蛋白表达水平升高(P<0.05)。见表2,图2。

图2 3组细胞NRSN2和NF-κB(p65)蛋白条带图

表2 3组细胞miR-488和NRSN2表达比较

2.3 miR-488靶向结合NRSN2 对调控NRSN2的miRNA进行预测。结果显示,有83个miRNA与NRSN2存在≥8个碱基互补,包括miR-488。荧光素酶报告实验结果显示,在野生型NRSN2中,miR-488组荧光强度低于miR-NC组[(0.48±0.03)∶(1.00±0.07),t=4.363,P<0.001];而在突变型NRSN2中,miR-488组和miR-NC组荧光强度差异无统计学意义[(0.98±0.08)∶(1.02±0.07),t=0.388,P=0.717]。见图3。

图3 miR-488靶向结合NRSN2;A NRSN2靶miRNA预测分析;B miR-488与NRSN2结合位点

2.4 抑制NF-κB信号通路拮抗miR-488对骨肉瘤细胞增殖和侵袭的影响 Western blot结果显示,与si-miR-488组比较,si-miR-488+IKK-16组NF-κB(p65)蛋白表达水平降低(P<0.05)。CCK8结果显示,与si-miR-488组比较,si-miR-488+IKK-16组细胞增殖水平降低,在72 h时表现出显著性差异(P<0.05);与si-NC组比较,si-miR-488+IKK-16组细胞增殖水平没有显著性差异(P>0.05)。Transwell结果显示,与si-NC组比较,si-miR-488组细胞24 h的侵袭水平减少,差异有统计学意义(P<0.05);与si-NC组比较,si-miR-488+IKK-16组细胞24 h的侵袭水平无显著性差异(P>0.05)。见表2、3,图3。

si-NC组 si-miR-488组 si-miR-488+IKK-16组

2.5 沉默miR-488促进骨肉瘤细胞增殖和侵袭 CCK8结果显示,与si-NC组比较,si-miR-488组细胞增殖水平增加,在72 h时表现出显著性差异(P<0.05)。Transwell结果显示,与si-NC组比较,si-miR-488组细胞24 h的侵袭水平增加(P<0.05)。见表3,图4。

表3 3组细胞增殖水平和侵袭能力比较

3 讨论

骨肉瘤属于常见的原发性恶性肿瘤,多发于青少年[10,11]。自20世纪70年代至今,手术切除和药物化疗一直是骨肉瘤的主要治疗手段,患者总体生存率停滞于60%左右[12]。截肢手术是20世纪70年代前治疗骨肉瘤的标准方法,但该种手术对患者的肢体功能影响大,带来的心理伤害也不可估量,大部分截肢术患者死于确诊后1年内,5年内生存率较低[13]。随着科技的发展,分子靶向治疗、免疫靶向治疗和基因靶向治疗逐渐成为研究热点。

NRSN2依赖NRSN1微管蛋白结合运输系统,是神经轴突生长的关键步骤[14]。既往研究发现,NRSN2与人类癌细胞有关,与邻近的非肿瘤组织相比,人类乳腺癌组织中 NRSN2 基因和蛋白质的表达水平显着上调[15]。Keremu等[16]发现,NRSN2可以通过PI3K/Akt/MTOR和Wnt/β-catenin信号通路促进骨肉瘤细胞增殖与生长,但是NRSN2影响骨肉瘤的机制仍需进一步研究。本实验中,我们发现与癌旁组织比较,肿瘤组织NRSN2表达水平升高,这与前人的研究结果[16,17]一致,提示NRSN2参与了骨肉瘤的发生发展。

随着生物信息技术的发展,miRNA已成为基础医学研究的一个重要领域,对基因的表达具有强大的调控作用,也可以作为多种疾病的生物标志物[17]。这些小的非编码RNA可通过识别3’ UTR位点作用于mRNA,从而调节它们的稳定性,进而影响基因表达水平。miRNA表达的微小变化都可能影响对靶基因调节的程度,从而影响细胞稳态[18]。因此,miRNA 的相对水平及其靶mRNA 可能在各类疾病中发挥关键作用。有研究表明miRNA参与了癌症的发展,miRNA表达的失调与各种癌症相关,例如在骨肉瘤中,miRNA-1286轴通过诱导氧化应激来抑制细胞侵袭性表型和肿瘤生长,表明miRNA-1286可能作为一种新型的抗肿瘤药物[19]。Sun等[20]研究发现,与正常成骨细胞系细胞和相邻非肿瘤组织比较,miR-646在骨肉瘤细胞系和骨肉瘤组织中下调,并与肿瘤的转移有关,而miR-646 的过表达抑制细胞增殖、迁移和侵袭。以上结果均表明miRNA在在骨肉瘤中发挥重要的调控作用。在本实验中,通过使用miRNA-seq技术,我们发现在NRSN2高表达肿瘤组织中,有276个miRNA表达升高,其中miR-488降低显著。通过生物信息学预测发现,与NRSN2 3’UTR存在8个碱基以上结合位点的miRNA共有83个,其中也包括miR-488。显示miR-488可能靶向结合并调控NRSN2表达。先前的研究表明,miR-488 在多种癌症中发挥抑癌作用[2]。而最新研究表明,miR-488在骨肉瘤中表达下调,miR-488过表达可抑制骨肉瘤细胞系的增殖、侵袭[6]。在本实验中,我们发现沉默miR-488促进骨肉瘤细胞增殖和侵袭,这与之前的研究结论一致。

通过相关性分析,我们发现NRSN2与miR-488的表达成负相关性,进一步的荧光素酶报告实验结果显示NRSN2与miR-488存在靶向作用,当沉默miR-488可以抑制的表达。以上结果说明,miR-488通过靶向抑制NRSN2发挥抗肿瘤的作用。NF-κB(nuclear factor-kappaB nuclear factor-kappa B)转录因子家族广泛存在于真核细胞中,调控着细胞的生存、生长和凋亡过程,参与炎症、免疫性疾病及肿瘤等疾病的发生与发展[21]。本研究发现沉默miR-488可以激活NF-κB信号通路,而当使用NF-κB拮抗剂抑制该信号通路后,可以逆转miR-488下调对骨肉瘤细胞增殖和侵袭的影响。以上结果说明,miR-488能够靶向NRSN2干预NF-κB信号通路,从而抑制肿瘤细胞的增殖和侵袭。

综上所述,miR-488和NRSN2的表达在骨肉瘤患者体内呈负相关,miR-488可能通过靶向负调控NRSN2的表达抑制肿瘤发展,并且机制可能是通过NF-κB介导的。表明miR-488和NRSN2有望作为新的骨肉瘤的治疗靶点,miRNA的策略可为进一步探讨骨肉瘤的免疫疗法提供新的思路。