乳腺癌细胞着丝粒蛋白W表达水平对抗肿瘤药物TEOA敏感性的影响

王陆洋 张寅昊 孙晓彤 李可意 周俊宇 唐陆胜 杨陈 王莹

最新全球癌症负担数据显示，女性乳腺癌发病率达31%，且预后差、复发率和死亡率均较高[1-4]。新型免疫疗法被认为可有效提高患者疗效和相对生存率，但在低收入人群较多的发展中国家，免疫疗法的经济负担仍然较重[5-6]，术后化疗仍是现阶段治疗乳腺癌的一线疗法。但长期使用化疗药物极易产生耐药性，患者预后不理想[7-8]。因此，寻找更为有效的治疗方案成为当前的研究热点[9]。早期筛查乳腺癌并发现潜在治疗靶点有助于降低乳腺癌死亡率，是延长患者生存期的新策略[10-11]。着丝粒蛋白W（centromeric protein W，CENPW）是构成着丝粒核小体的重要组成部分，在多种肿瘤组织中高表达[12-13]。已有研究发现，CENPW 可影响结肠癌细胞迁移，并通过TGF-β 信号通路影响肺癌进程[14-15]。此外，紧密连接蛋白1（claudin-1，CLDN1）是细胞间通讯和调节上皮-间充质转化的关键，同样在癌症进展和转移过程中发挥重要作用[16-17]。Wang 等[18]研究认为CENPW 可能是乳腺癌发展过程中的重要生物标志物，下调CENPW 表达是抑制乳腺癌发展的一种前瞻性策略。2α,3α,24-三羟基-12-烯-28-乌苏酸（2α,3α,24-thrihydroxyurs-12-en-28-oicacid，TEOA）是从草药毛花猕猴桃根中提纯出的一种五环三萜类化合物，表现出显著的抗肿瘤活性[19]。本研究探讨乳腺癌细胞CENPW 表达水平对抗肿瘤药物TEOA 敏感性的影响，以期提高TEOA 对乳腺癌的治疗效果。

1 材料和方法

1.1 材料 人乳腺癌细胞系MDA-MB-231 购自中国科学院细胞库，在含10%FBS 的DMEM 培养基中培养，培养箱条件为37 ℃、5% CO2，细胞密度达到80%时进行传代培养。TEOA（粉剂，10 mg）由浙江大学药学院赠予，用二甲基亚砜配成10 mmol/L的母液，备用。无血清培养基购自浙江森瑞生物科技有限公司。转染试剂盒LipofectamineTM3000 购自美国Invitrogen 公司。两对靶向CENPW 的沉默RNA（siRNA：si1-CENPW、si2-CENPW）和阴性对照siRNA-NC（si-NC）序列由广州锐博生物技术有限公司合成。细胞增殖与毒性检测（cell counting kit-8，CCK-8）试剂盒、二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白检测试剂盒、Hoechst 核染色试剂、碘化丙啶染色试剂和辣根过氧化物酶-偶联二抗购自上海碧云天生物技术有限公司。增强电化学（enhanced chemiluminescence-plus，ECL-Plus）超敏发光液购自杭州弗德生物科技有限公司。RIPA 细胞裂解液购自美国Sigma-Aldrich 公司。CENPW（批号：NBP1-70496）抗体购自美国Novus 公司。CLDN1（批号：ab242370）抗体、细胞周期蛋白D1（CyclinD-1；批号：ab134175）抗体、转录抑制因子2 蛋白（Slug；批号：ab302780）抗体、去乙酰化酶3 蛋白（Sirtuin 3，SIRT3；批号：ab217319）抗体、B 细胞淋巴瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2；批号：ab182858）抗体和β-肌动蛋白（β-actin；批号：ab8227）抗体购自英国Abcam 公司。

1.2 细胞转染 si-NC 序列：F-UUCUCCGAACGUGUCACGU， R-AAGAGGCUUGCACAGUGCA； si1-CENPW 序列：F-GCAGAAGAGUCCAGGACAA，RCGUCUUCUCAGGUCCUGUU；si2-CENPW 序列：FGGAGAAAA-GUGGUGACUUA，R-CCUCUUUUCACCACUGAAU。取对数生长期的MDA-MB-231 细胞，调整密度为5×105个/孔，接种于6 孔板，培养24 h。根据LipofectamineTM3000 转染试剂盒方法，依次加入稀释后的si-NC、si1-CENPW 和si2-CENPW，使用无血清培养基于37 ℃培养箱中孵育12 h 后更换含血清培养基继续培养36 h，得到转染细胞。

1.3 细胞分组和处理 分组1：细胞分为si-NC 组（转染si-NC 序列）、si1-CENPW 组（转染si1-CENPW 序列）和si2-CENPW组（转染si2-CENPW序列）。分组2：细胞分为si-NC 组、si1-CENPW 组、si-NC+TEOA 组（细胞转染si-NC序列后，再经TEOA处理）和si1-CENPW+TEOA组（细胞转染si1-CENPW序列后，再经TEOA处理）。

1.4 3 组细胞CENPW、CLDN1 蛋白表达的检测 采用Western blot 法。取分组1 的3 组细胞，1 000 r/min 离心3 min，弃去上清液加入RIPA 裂解液，提取蛋白溶液。根据BCA 蛋白检测试剂盒检测每组蛋白样品浓度，稀释样品蛋白浓度至2 μmol/L。各组蛋白样品加入到含10% SDS-PAGE 的凝胶中电泳分离，并将其标记在聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fldoride，PVDF）膜上。印迹的PVDF 膜放置在5%的脱脂牛奶中常温封闭1 h，加入CENPW、CLDN1 一抗，4 ℃摇床孵育过夜。取出样品，分别加入二抗，室温摇床孵育1 h。用ECL-Plus 超敏发光液于伯乐凝胶成像仪中观察印迹。以β-actin作为内参，计算CENPW、CLDN1 蛋白相对表达量。

1.5 3 组细胞迁移能力的检测 采用贴壁细胞划痕实验。取分组1 的3 组细胞分别接种到6 孔板，待细胞生长至95%细胞密度时，用10 μL 移液管尖划开细胞层，在0 和24 h 采集图像，利用Image J 软件测量划痕距离，评估细胞迁移能力。

1.6 两组细胞存活率的检测 采用CCK-8 法。取分组2 的si-NC+TEOA 组和si1-CENPW+TEOA 组细胞。调整密度为1×104个/孔，接种于96 孔板中。分别用含0、40、45、50 μmol/L TEOA 的无血清培养基培养24 h。加入10 μL/孔CCK-8 孵育1.5 h，酶标仪检测450 nm 波长处的吸光度值，计算两组细胞存活率。

1.7 两组细胞死亡率的检测 采用碘化丙啶染色法。取分组2 的si-NC+TEOA 组和si1-CENPW+TEOA 组细胞，调整密度为80%，接种于6 孔板中并培养至贴壁。加入50 μmol/L TEOA，1.5 mL/孔，培养24 h。转移至6孔板，加入1 g/L 碘化丙啶染色试剂，1.5 μL/孔，避光染色15 min，继用Hoechst 染色5 min。使用荧光显微镜观察拍照并计数，计算细胞死亡率。

1.8 4 组细胞中cyclinD-1、Slug、SIRT3、Bcl-2 蛋白表达的检测 取分组2 的4 组细胞，参照1.4.1 方法，采用Western blot 法检测计算CyclinD-1、Slug、SIRT3、Bcl-2蛋白相对表达量。

1.9 统计学处理 采用GraphPad Prism 5.0 和SPSS 22.0 统计软件。计量资料多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t法。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3 组细胞CENPW、CLDN1 蛋白表达水平的比较与si-NC 组相比，si1-CENPW 组和si2-CENPW 组的CENPW、CLDN1 蛋白相对表达水平均显著降低，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见图1。

图1 3 组细胞CENPW、CLDN1 蛋白表达的比较（A：蛋白电泳图；B：CENPW、CLDN1 蛋白相对表达水平）

2.2 3 组细胞迁移能力的比较 相比si-NC 组，si1-CENPW 组和si2-CENPW 组的划痕距离较宽（P＜0.05），提示细胞迁移相对距离较短，细胞迁移能力降低，见图2。

图2 3 组细胞迁移能力的比较（A：贴壁细胞划痕图；B：细胞划痕相对距离）

2.3 两组细胞存活率的比较 随着TEOA 药物浓度升高，si1-CENPW+TEOA 组细胞存活率逐渐降低。在药物浓度为50 μmol/L 时，si1-CENPW+TEOA 组与si-NC+TEOA 组细胞存活率差值最大；相比si-NC+TEOA组，45、50 μmol/L TEOA 处理下si1-CENPW+TEOA 组的细胞存活率明显降低，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见图3。

图3 两组细胞存活率的比较

2.4 两组细胞死亡率的比较 碘化丙啶和Hoechst染色结果显示，当TEOA 药物浓度为50 μmol/L 时，si1-CENPW+TEOA 组的细胞死亡数量较si-NC+TEOA 组显著增加，差异有统计学意义（P＜0.05），见图4（插页）。

图4 两组细胞死亡率的比较（A：碘化丙啶荧光染色图，×200；B：细胞死亡率）

2.5 4 组细胞中CyclinD-1、Slug、SIRT3、Bcl-2 蛋白表达水平的比较 相比si-NC+TEOA 组，si1-CENPW+TEOA 组中CyclinD-1、Slug、SIRT3 的蛋白相对表达水平均显著降低，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。相比si1-CENPW 组，si1-CENPW+TEOA 组中CyclinD-1、Slug、SIRT3、Bcl-2 的蛋白相对表达水平均显著降低，差异均有统计学意义（均P＜0.01），见图5。

图5 4 组细胞CyclinD-1、Slug、SIRT3、Bcl-2 蛋白表达水平的比较（A：蛋白电泳图；B：CyclinD-1、Slug、SIRT3、Bcl-2 蛋白相对表达水平）

3 讨论

乳腺癌仍然是近年来女性中发病率最高的癌症，其中浸润性乳腺癌是原发性乳腺癌最常见的病理类型，治疗方案一般为术后化疗[20-21]。由于化疗药物往往伴随着严重的毒副反应和耐药性，乳腺癌患者的预后总是差强人意[22-24]。因此，在基因层面上开发更有效、更小毒性反应的治疗策略是必要的[25-26]。着丝粒蛋白的调控与肿瘤细胞的细胞周期密切相关[27-28]，并通过核仁磷酸蛋白（nucleophosmin，NPM）1 蛋白和TGF-β 信号通路加速细胞转化[29-30]。CENPW 是一种有前景的基因靶点，干扰其表达有较好的抑癌效果[31-32]。为阐明CENPW 基因在乳腺癌发生、发展中的关键作用，本研究构建了干扰CENPW 基因表达的乳腺癌细胞，发现抑制CENPW 表达的同时也阻碍了CLDN1 的表达。CLDN1 在具有免疫逃逸特性的肿瘤病理学中起关键作用，干扰CLDN1 的表达能够抑制乳腺癌细胞上皮-间充质转化[33-35]。两者之间存在上下游关系并呈正相关调节，使细胞迁移能力显著降低。

将CENPW 作为乳腺癌进展的预测因子，以干扰其表达为切入点联合化疗药物治疗有助于开发具有创新性的乳腺癌治疗策略。TEOA 是从毛茛根中分离出来含量最多的五环三萜化合物，在体内和体外均表现出强大的抗癌活性，并通过诱导线粒体活性氧的产生引发细胞凋亡和氧化应激来达到抑癌效果[36-37]。本研究发现，TEOA 对CENPW 表达失调的乳腺癌细胞造成的杀伤效果更强，低浓度TEOA 即可杀伤更多细胞。细胞中CyclinD-1、Slug、SIRT3、Bcl-2 的蛋白表达水平在抑癌过程中发挥着重要作用，抑制CyclinD-1 的表达能阻碍细胞增殖，干扰Slug 的表达能阻碍其调控的上皮-间充质转化，SIRT3 的缺失可导致线粒体活性氧水平异常并诱导氧化应激，下调Bcl-2 有助于细胞凋亡的发生[38-43]。本研究结果表明，TEOA 抑制了乳腺癌细胞中CyclinD-1、Slug、SIRT3、Bcl-2 的蛋白表达，而这一效果在CENPW 表达失调的细胞中更为显著。干扰CENPW 的表达能增加细胞对抗肿瘤药物TEOA 的敏感性，通过减少药物用量有效降低TEOA 的毒性反应并存在缓解耐药性的可能性。然而一个基因调节多种代谢途径，其具体作用机制不能用单一的信号通路来清楚地解释，因此本研究的意义尚存在一定局限，需通过进一步的临床试验加以验证。

综上所述，本研究证实干扰CENPW 表达可抑制乳腺癌细胞的生物学行为，与TEOA 抗肿瘤药物联合应用可对乳腺癌细胞起抑制效果。但本研究仅局限于细胞生物学层面，在体内是否存在同样高效的抑癌效果，有待进一步研究。