CYP2C9*3和VKORC1基因位点突变对华法林稳定剂量及PT-INR达标天数的影响*

焦瑞宝,刘 洋,周佳丽,张 盛,陈继中

铜陵市人民医院临床检验中心,安徽铜陵 244000

华法林是口服后间接发挥作用的双香豆素类抗凝剂,其化学结构与维生素K相似,是通过竞争性拮抗维生素K,进而影响维生素K依赖性凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ在肝脏的合成,对血液中已经存在的上述4种因子无抵抗作用。可用于治疗血栓栓塞性疾病,防止血栓的形成与发展,治疗手术后或创伤后的静脉血栓形成,可预防血栓栓塞性疾病。华法林是迄今为止使用最多的口服抗凝药,因其作用时间长,服用方便,价格低廉等优点而成为长期抗凝治疗的首选药物,但其治疗窗很窄,掌控好抗凝治疗强度非常重要,华法林抗凝用量不足,容易形成血栓栓塞。用药过量易致各种出血,早期表现有瘀斑、紫癜、牙龈出血、鼻衄、月经量增多、伤口出血经久不愈,出血也可发生在泌尿道和消化道。凝血酶原时间-国际标准化比值(PT-INR)被公认用于衡量华法林的抗凝强度,中等强度抗凝即PT-INR在2.0～3.0是安全范围,患者需要定期监测PT-INR并及时调整服药剂量,就可以降低出血等不良反应的发生。影响华法林药效因素主要有遗传和非遗传因素,华法林作用靶点——维生素K环氧化物还原酶复合体亚单位1(VKORC1)、华法林代谢酶——细胞色素P450酶2C9(CYP2C9)是目前影响华法林抗凝时给药剂量个体化差异最主要的遗传因素[1]。《华法林抗凝治疗的中国专家共识》认为基因多态性可解释30%～60%的个体差异[2]。本研究回顾性收集住院抗凝患者上述两个基因位点多态性信息和其他基本资料,探讨VKORC1和CYP2C9*3基因位点突变对华法林抗凝效果的影响,指导临床个体化用药。现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 回顾性收集2019年8月至2022年1月在铜陵市人民医院住院的患者69例,其中男31例,女38例,年龄25～87岁,平均(68.88±12.14)岁,纳入标准:正在接受华法林抗凝治疗患者,包括脑梗死、心功能不全、心脏瓣膜病、风湿性心脏病等;排除标准:肝肾功能不全、凝血功能障碍或合并严重疾病的患者。

1.2仪器与试剂 PyroMark Q24 MDx实时荧光定量焦磷酸序列分析仪、东胜ETC 811基因扩增仪、MX-M型混匀仪、MX-S型漩涡震荡仪、STAR-MAX全自动凝血分析仪,DNA提取试剂盒、测序反应通用试剂盒(长沙三济公司)、脱氧核糖核苷三磷酸试剂(日本TakaRa公司),凝血酶原时间试剂(上海太阳生物公司)。

1.3方法

1.3.1VKORC1和CYP2C9*3检测 采集所有研究对象静脉血2 mL,乙二胺四乙酸二钾抗凝,采用硅胶柱提取、纯化基因组DNA,将提取的DNA进行聚合酶链反应(PCR),反应条件:95 ℃预变性5 min,94 ℃变性25 s,56 ℃退火25 s,72 ℃延伸25 s,共35个循环,最后72 ℃延伸5 min。采用PyroMark Q24 MDx实时荧光定量焦磷酸序列分析仪测定扩增产物VKORC1和CYP2C9*3位点基因多态性。

1.3.2凝血酶原时间及PT-INR检测 采集所有研究对象静脉血2 mL,枸橼酸钠抗凝,1 610×g离心10 min获得血浆备用,运用STAR-MAX全自动凝血分析仪采用磁珠法测定凝血酶原时间,并与健康人群比较计算获得PT-INR。

1.3.3华法林稳定剂量与PT-INR达标天数检测 PT-INR连续检测3次,每次监测间隔时间3 d,连续3次PT-INR达到目标抗凝强度范围且华法林剂量未发生改变,即为华法林稳定剂量,所用天数为PT-INR达标天数。

2 结 果

2.169例患者两种基因型分布情况 VKORC1野生型占85.51%(59/69),突变型占14.49%(10/69)。CYP2C9*3野生型占89.86%(62/69),突变型占10.14%(7/69)。两种基因位点均为野生型占78.26%(54/69),一种基因位点突变占18.84%(13/69),两种基因位点均突变占2.90%(2/69)。见表1。

表1 69例住院患者VKORC1与CYP2C9*3基因型分布情况(n)

2.2VKORC1基因型对华法林稳定剂量及PT-INR达标天数的影响 VKORC1基因型AG+GG的华法林稳定剂量和PT-INR达标天数均大于VKORC1基因型AA,差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 VKORC1基因型对华法林稳定剂量及PT-INR达标天数影比较

2.3CYP2C9*3基因型对华法林稳定剂量及PT-INR达标天数的影响 CYP2C9*3基因型AC的华法林稳定剂量低于CYP2C9*3基因型AA,CYP2C9*3基因型AC的PT-INR达标天数大于CYP2C9*3基因型AA,差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 CYP2C9*3基因型对对华法林稳定剂量及 PT-INR达标天数影响比较

2.4两种基因型组合对华法林稳定剂量及PT-INR达标天数的影响 VKORC1基因型AA+CYP2C9*3基因型AC的华法林稳定剂量均低于其他VKORC1+CYP2C9*3基因型组合,VKORC1基因型AG/GG+CYP2C9*3基因型AA的华法林稳定剂量高于其他VKORC1+CYP2C9*3基因型组合,差异有统计学意义(P<0.05);而VKORC1基因型AA+CYP2C9*3基因型AA的华法林稳定剂量与VKORC1基因型AG+CYP2C9*3基因型AC比较,差异无统计学意义(P>0.05)。VKORC1基因型AA+CYP2C9*3基因型AA 的PT-INR达标天数少于其他VKORC1+CYP2C9*3基因型组合,差异有统计学意义(P<0.05);VKORC1基因型AA+CYP2C9*3基因型AC、VKORC1基因型AG/GG+CYP2C9*3基因型AA、VKORC1基因型AG+CYP2C9*3基因型AC的PT-INR达标天数比较,差异无统计学意义(P>0.05)。见表4。

表4 两种基因型组合对华法林稳定剂量及PT-INR达标天数的影响

3 讨 论

华法林是临床上使用最广泛,也是最有效的抗凝药物,华法林药代动力学口服胃肠道吸收迅速而完全,生物利用度高达100%,吸收后与血浆蛋白结合率达98%～99%,由肝脏代谢,代谢产物经肾脏排泄,服药后12～18 h起效,36～48 h达抗凝高峰,维持3～6 d,血浆半衰期36～42 h。抗凝效果易受饮食、合并用药、遗传因素等影响,其最佳剂量因不同地区、不同民族而有所差异,某些疾病如长期腹泻或呕吐、泛氧状态、化疗、发热和甲状腺功能亢进等,以及肝功能异常、慢性肾功能不全时华法林需求也会降低;富含维生素K的食物可降低华法林疗效,如酸奶酪、蛋黄、绿叶蔬菜等,某些西药和中药会影响华法林药效[3]。

近年来,随着药物基因组学深入研究和发展,发现华法林药代动力学和药效学通路上某些基因的遗传变异可能是造成个体间华法林差异的主要原因之一。随着药物基因组学的发展,全基因组关联研究和临床研究表明,CYP2C9和VKORC1基因在华法林发挥抗凝作用中起主要作用[4]。

VKORC1基因集中位于16号染色体上,在维生素K依赖性凝血因子(Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ)生成中发挥着主导作用,属于华法林作用靶点。有研究证实[5],VKORC1等位基因A突变为等位基因G,可促使VKORC1蛋白合成及其酶活性明显降低,如需达到相同的抗凝强度,所需华法林剂量明显增加,首次达标时间明显延长。本研究结果显示,VKORC1基因型AG+GG的华法林稳定剂量和PT-INR达标天数均大于VKORC1基因型AA,差异有统计学意义(P<0.05),与武元竹等[6]研究结果一致。

华法林是R-华法林和S-华法林对映异构物外消旋混合物,其中S-华法林的抗凝活性是R-华法林的3～5倍,并主动经CYP2C9酶代谢。CYP2C9基因位于10号染色体上,具有高度遗传多态性,其中CYP2C9*2和CYP2C9*3最为常见[7-9]。CYP2C9作为华法林的S异构体代谢酶,其*2与*3位点基因变异可导致CYP2C9酶活性降低,致使华法林S异构体代谢减弱,华法林血药浓度增加,出现过度抗凝,增加患者出血风险。有研究显示*2与*3位点基因变异可分别使华法林S异构体代谢降低30%～40%和80%～90%,故此类人群达到相同抗凝强度,所需华法林剂量明显减少[10-11]。本研究结果显示,CYP2C9*3基因型AC的华法林稳定剂量低于CYP2C9*3基因型AA,差异有统计学意义(P<0.05),说明华法林代谢药物在体内蓄积,造成血药浓度增高。

本研究结果显示,VKORC1基因型AA+CYP2C9*3基因型AC的华法林稳定剂量均低于其他VKORC1+CYP2C9*3基因型组合,差异有统计学意义(P<0.05),可能是由于作用靶点正常,而代谢酶活性下降,其血药浓度升高引起的;VKORC1基因型AG/GG+CYP2C9*3基因型AA的华法林稳定剂量高于其他VKORC1+CYP2C9*3基因型组合,差异有统计学意义(P<0.05),可能是由于作用靶点减少,为了达到足够抗凝效果,需要更高剂量来维持。与武元竹等[6]研究结果一致。

基于华法林药物基因组学(包括基因型)构建药物模型,华法林药物基因组学联合会建立华法林剂量公益网站(www.warfarindosing.org),可根据患者的基因型和临床特征(如性别、种族、年龄、身高、体重、临床诊断、用药情况等)自动计算出华法林推荐剂量。既往多项研究表明,性别、年龄、身高、体重、CYP2C9、VKORC1基因多态性可以解释30%～60%的华法林剂量个体差异[12-14]。当然还有其他基因如CYP4F2、APOE、GGCX、EPHX1基因多态性也是华法林个体差异的重要影响因素[15]。目前,为了减少经验性用药造成PT-INR达标天数的延长,临床上可以运用遗传药理学算法预测华法林剂量,开展个体化用药指导。

综上所述,VKORC1和CYP2C9*3两个基因位点多态性与华法林稳定剂量和PT-INR达标天数有关,在临床相关疾病抗凝过程中需考虑其影响,指导个体化用药,努力减少经验性用药,缩短PT-INR达标天数,早日达到满意抗凝效果。