Vitek2 Compact AST-P639中国定制药敏卡对金黄色葡萄球菌体外药敏、耐药表型及AES修正能力评估

梁美春 王萍 张小姣 何秋丽 吕黎 周宜庆 张海旺 茅国峰 王朵

金黄色葡萄球菌是医院和社区获得性感染最重要和最具挑战性的病原体之一，尤其是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（methicillin-resistant Staphylococcus au‐reus，MRSA）引起抗菌药物耐药性不断增加而越来越受到人们的关注。因此快速准确的药敏结果对临床实现快、准、狠的个性化抗感染精准治疗显得尤为重要。目前临床微生物实验室的体外药敏试验多数采用Vitek2 Compact全自动细菌药敏分析系统，其自带的高级专家系统（advanced expert system，AES）可对细菌的药敏结果进行自动判断，根据药敏结果综合分析筛选出MRSA、红霉素诱导克林霉素耐药试验，并根据耐药表型对药敏结果进行修正。2016年，梅里埃公司联合中国的行业专家共同定制出了更符合中国临床需求的药敏卡即中国定制药敏卡，其中包括革兰阳性球菌AST-P639药敏卡，该卡在原来卡片的基础上删除了四环素、呋喃妥因，增加了头孢洛林、达托霉素、替考拉宁等，基本覆盖了临床常用的各类抗菌药物，无需手工补贴药敏纸片。为评估AST-P639中国定制药敏卡（以下称中国定制卡）对金黄色葡萄球菌体外药敏、MRSA、红霉素诱导克林霉素耐药试验、AES修正能力的准确性和可靠性，本研究以美国临床和实验标准化协会（CLSI）推荐的微量肉汤稀释法、D试验及PCR测mecA、mecC基因为参考方法，对中国定制卡的可靠性进行评估，现报道如下。

1 资料和方法

1.1 一般资料选取2020年5月至2021年9月绍兴市人民医院临床分离的非重复金黄色葡萄球菌100株，其中痰液35株，脓液15株，手术切缘14株，分泌物14株，血液6株，渗出液11株，其余5株。

1.2 方法标本采集和培养参照《全国临床检验操作规程》第4版进行，血琼脂平板购于郑州安图生物工程股份有限公司。

1.3 仪器与试剂采用梅里埃Vitek MS质谱鉴定仪及Vitek2 Compact型自动微生物药敏仪，配套中国定制卡，均购自法国梅里埃公司。万古霉素、替考拉宁、替加环素、利奈唑胺、达托霉素、苯唑西林、红霉素、克林霉素、左氧氟沙星、复方新诺明和利福平同时采用微量肉汤稀释法进行药敏检测，试剂购自温州康泰生物科技有限公司（批号：VE06160）。红霉素纸片（规格：15 μg，批号：3380421）、克林霉素纸片（规格：2 μg，批号：3443630）购自英国Oxoid公司；MH琼脂平板购自郑州安图生物工程股份有限公司。DNA提取试剂盒购自上海生工生物工程有限公司；PCR仪购自美国塞默飞公司（型号：7300PLUS）；Taq酶和PCR反应相关试剂购自杭州擎科生物工程有限公司；电泳仪购自上海天能科技有限公司（型号：EPS-300）；紫外成像系统为购自法国Teleflex Incorporated公司（型号：TFX-20M）。

1.4 药敏试验质谱仪鉴定为金黄色葡萄球菌的菌株，采用PCR方法检测金黄色葡萄球菌特异性热核酸酶基因nucA[1]确认菌株为金黄色葡萄球菌。采用微量肉汤稀释法进行药敏试验，按照CLSIM100 S31[2]判定结果；中国定制卡的操作按照厂家说明书进行，药敏结果根据系统自带专家系统自动给出，质控菌株采用ATCC29213。

1.5 MRSA表型测定及基因确证试验中国定制卡以头孢西丁6.00 μg/mL筛选MRSA表型，并根据头孢西丁表型结果对苯唑西林的药敏结果进行修正；采用常规PCR检测mecA、mecC基因进行确证。MRSA阳性质控菌株为ATCC43300，MRSA阴性质控菌株为ATCC29213。

1.6 DNA的提取用无菌环挑取适量金黄色葡萄球菌单个菌落，于300 μL 0.9%氯化钠注射液中研磨混匀，10 000 r/min离心3 min，弃上清液，收集菌体。严格按照细菌DNA提取试剂盒说明书进行操作,并对提取后的DNA使用超微量核酸蛋白测定仪检测浓度和纯度。

1.7 mecA、mecC基因PCR扩增mecA、mecC基因的扩增根据参考文献[3-4]进行，引物序列委托杭州擎科生物工程有限公司合成。扩增产物送至上海生工生物工程有限公司进行测序，测序结果与GenBank数据库进行比对。

1.8 红霉素诱导克林霉素耐药试验D试验参照《全国临床检验操作规程》第4版，红霉素纸片、克林霉素纸片中心点相距为15～20 mm，在靠近红霉素纸片一侧克林霉素的抑菌环有截平现象，即D试验阳性。中国定制卡采用微量肉汤稀释法，以克林霉素0.5 μg/mL和红霉素0.25 μg/mL来监测红霉素诱导克林霉素耐药，如果2个孔都明显浑浊或都不浑浊，则为红霉素诱导克林霉素耐药试验阴性，如果第1个孔不浑浊而第2个孔浑浊则为红霉素诱导克林霉素耐药试验阳性。AES根据红霉素诱导克林霉素耐药试验阳性结果，对克林霉素药敏结果进行修正。

1.9 相关定义极大错误（very major error，VME）：参考方法判读为耐药，待测方法为敏感；大错误（major error，ME）：参考方法判读为敏感，待测方法为耐药；小错误（minor error，MIE）：任何一方为中介，另一方为敏感或耐药。分类一致性（categorical agreement，CA）：待测方法与参考方法判读结果的一致性，如两者均判读为敏感、中介或耐药[5]。

1.10 方法学比对当待测方法与参考方法的比对结果同时完全满足以下要求时，则为可接受：VME＜1.50%、ME＜3.00%、VME+ME＜5.00%、VME+ME+MIE均＜10.00%（即CA＞90.00%）[5]。

1.11 统计学处理采用WHONET 5.6软件和SPSS 17.0统计软件。计数资料以例（%）表示，组间比较采用Fisher确切概率法。一致性检验采用Kappa检验，Kappa值≥0.90为一致性非常好，0.75＜Kappa值＜0.90为一致性较好，0.4＜Kappa值≤0.75为一致性中等，Kappa值≤0.4为一致性较差。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 中国定制卡体外药敏结果可靠性分析与参考方法比较，中国定制卡对金黄色葡萄球菌体外药敏CA为95.38%，VME、ME、MIE分别为0.31%、3.77%、0.54%，均在可接受范围内。其中万古霉素、替考拉宁、替加环素、利奈唑胺、达托霉素CA均为100.00%，红霉素、左氧氟沙星、复方新诺明和利福平的CA分别为95.00%、94.00%、98.00%、97.00%。红霉素的VME为1.00%，ME为2.00%，MIE为2.00%；左氧氟沙星、复方新诺明和利福平的ME均为2.00%，利福平出现了1.00%的MIE，而左氧氟沙星出现了4.00%的MIE范围，但均在可接受范围内。见表1。

表1 中国定制卡与参考方法间的差异性分析

2.2 MRSA、红霉素诱导克林霉素耐药试验结果可靠性分析将100株金黄色葡萄球菌进行DNA提取，采用PCR方法检测mecA、mecC基因，检出mecA 71株，未检出mecC菌株；采用中国定制卡筛选出69株MRSA菌株，CA为98.00%。中国定制卡69株MRSA菌株均检出mecA基因，2株mecA基因在对甲氧西林敏感的金黄色葡萄球菌（methicillin sensitive Staphylococcus aureus，MSSA）中检出。扩增结果见图1。

图1 PCR扩增金葡菌mecA基因凝胶电泳图

中国定制卡检出红霉素耐药、克林霉素敏感菌株30株，红霉素诱导克林霉素耐药试验阳性28株，阳性率为93.33%（28/30）；D试验检出红霉素耐药、克林霉素敏感菌株27株，D试验阳性27株，阳性率为100.00%，差异无统计学意义（P＞0.05），其中红霉素诱导克林霉素耐药试验2种方法的CA为97.00%。

2.3 中国定制卡与参考方法的一致性检验中国定制卡与参考方法一致性较好（Kappa=0.87，P＜0.01），其中万古霉素、替考拉宁、替加环素、利奈唑胺、达托霉素与参考方法完全一致（Kappa=1.00，P＜0.01），MRSA、红霉素诱导克林霉素耐药试验的一致性非常好（Kappa=0.95、0.93，均P＜0.01），克林霉素的一致性较差（Kappa=0.36，P＜0.01），苯唑西林、红霉素、左氧氟沙星、复方新诺明、利福平的一致性均为中等。见表1。2.4 AES修正结果分析及AES修正能力评估中国定制卡检出35株苯唑西林敏感菌株，因头孢西丁筛选阳性，AES将4株苯唑西林敏感菌株修正为耐药，与参考方法比较修正前CA为97.00%，出现了1.00%VME和2.00%ME。AES修正后虽然CA下降为95.00%，ME也上升至5.00%，但避免了VME的出现。被AES修正为耐药的4株苯唑西林敏感菌株，经PCR证实均携带mecA基因，为MRSA菌株。中国定制卡检出73株克林霉素敏感菌株，因红霉素诱导克林霉素耐药试验阳性，AES将28株克林霉素敏感株修正为耐药，修正前克林霉素CA为92.00%，VME为1.00%、ME为7.00%；AES修正后虽然避免了VME，但CA下降至66.00%，ME也升至34.00%，远超出了VME+ME+MIE＜10.00%的可接受范围。被AES修正的28株菌株经D试验证实，26株为D试验阳性，即AES存在7.14%（2/28）的错误修正率，见表1。

3 讨论

Vitek2 Compact全自动细菌药敏仪自动化流程操作简便，实现动态观察，方便快捷。既往研究表明Vitek2 Compact全自动细菌药敏仪在测定临床常用抗菌药物的体外药敏、常见耐药表型[5]和AES修正系统[6]具有较好的可靠性。中国定制卡对金黄色葡萄球菌药敏结果、耐药表型鉴定和AES修正能力目前尚不清楚。本研究发现，中国定制卡对金黄色葡萄球菌体外药敏的CA为95.38%，略低于田月如等[7]报道的中国定制卡，略高于乔宁等[8]报道的非定制卡，其中万古霉素、替考拉宁、替加环素、利奈唑烷与参考方法完全一致（CA均为100.00%，Kappa均为1.00，均P＜0.05），由于万古霉素、替考拉宁、替加环素、利奈唑烷、达托霉素对大多数革兰阳性菌具有很强的抗菌作用，据CH‐NET网（http://www.chinets.com/Chinet）显示，截至2022年上半年止，我国未检测出对万古霉素、替考拉宁、替加环素、利奈唑烷耐药的金黄色葡萄球菌，所以不能排除因无耐药菌株而导致的高一致性。复方新诺明、利福平、左氧氟沙星、红霉素的CA均＞90.00%，但均出现了不同程度的ME，红霉素甚至出现了1.00%的VME，这可能会误导临床医师错误选择抗菌药物而导致治疗失败。红霉素、左氧氟沙星、利福平分别出现了2.00%、4.00%、1.00%的MIE，提示在中介范围内的抗菌药物应谨慎使用。

MRSA的耐药机制主要是由mecA基因编码与β-内酰胺类抗菌药物亲和力低的PBP2a[9]。mecC基因与mecA基因在DNA水平上约有70%相似性，在氨基酸水平上有63%同源性[10]。mecC基因主要与动物有关，在人类中的患病率极低[11]，目前也德国、英国、丹麦、捷克检出[4，9-10]，国内未见相关报道，本研究也未检出mecC基因。中国定制卡筛选的MRSA表型与PCR方法一致性非常好（Kappa=0.95，P＜0.05），CA为98.00%，略高于魏丹丹等[12]报道的非中国定制卡。中国定制卡筛选的MRSA菌株均检出mecA基因，2株mecA基因在MSSA菌株中检出，表明定制卡筛选MRSA准确性高，但还是会有2%（2/100）的漏检，应引起关注。

苯唑西林不一致的结果中，1例菌株肉汤稀释法判读为耐药，而中国定制卡在AES修正前判读为敏感，修正后判读对相对耐药；5株菌株肉汤稀释法判读为敏感而中国定制卡判读为耐药，其中3株AES修正为相对耐药，即苯唑西林在AES修正前出现了1.00%的VME，修正后出现了5.00%的ME，同时修正后的CA值略低于修正前，但在AES修正为相对耐药的4株苯唑西林敏感菌株中均检出mecA基因，即与AES修正相符。多数情况下携带mecA基因或产生PBP2a的金黄色葡萄球菌对苯唑西林耐药，中国定制卡检出6株，肉汤稀释法检出7株苯唑西林敏感mecA基因阳性菌株（OS-MRSA），其中中国定制卡中4株苯唑西林敏感菌株AES将其修正为耐药，即中国定制卡检出2株、肉汤稀释法检出7株OS-MRSA菌株。有研究认为OSMRSA菌株的出现可能与PBP2a蛋白的低表达[13]、me‐cA基因的不稳定[14]、青霉素结合蛋白4（PBP4）和Fem酶活性以及blaR1基因[15]的缺乏有关，其机制有待于进一步研究。提示当存在OS-MRSA菌株时，中国定制卡AES修正结果的可靠性较高，可适当避免上述原因造成临床治疗失败。

克林霉素具有优越的药代动力学，能口服、经济、有效穿透组织的能力、不良反应少等优点，被临床广泛应用于革兰阳性菌引起的感染，尤其可作为青霉素和头孢菌素过敏患者的首选药物。红霉素诱导克林霉素耐药试验阳性表现为红霉素耐药而克林霉素敏感，但在实际治疗中克林霉素的治疗是无效的，故红霉素诱导克林霉素耐药试验结果可为临床规范使用抗菌药物提供指导。本研究中国定制卡红霉素诱导克林霉素耐药试验与D试验一致性非常好（Kappa=0.93，P＜0.01，CA=97.00%），与报道一致[16]。中国定制卡检出红霉素诱导克林霉素耐药试验阳性而D试验阴性菌株2株，中国定制卡检出红霉素诱导克林霉素耐药试验阴性而D试验阳性菌株1例，其中国定制卡红霉素诱导克林霉素耐药阳性率（93.33%）低于D试验（100.00%），但差异无统计学意义，且均高于相关报道[17]，这可能与各地区用药情况和耐药基因差异有关。提示中国定制卡红霉素诱导克林霉耐药的准确性非常高，但应注意假阳性和假阴性的发生。

克林霉素不一致的结果中，1株肉汤稀释法判读为耐药，中国定制卡在AES修正前判读为敏感，修正后判读对相对耐药；27株肉汤稀释法判读为敏感，中国定制卡AES修正前判读为敏感，修正后判读对相对耐药；修正前出现了1.00%的VME，修正后虽然出现了很高的ME（34.00%），一致性也较差（Kappa=0.36），但可以避免诱导性耐药而错误的选择无效抗菌药物，同时应注意AES对克林霉素存在的错误修正率（7.14%）。因本研究未对erm基因进行检测，故不能排除中国定制卡对红霉素诱导克林霉耐药表型的准确性、AES错误修正率存在一定的影响。

综上所述，Vitek2 Compact AST-P639中国定制药敏卡对金黄色葡萄球菌体外药敏、MRSA表型、红霉素诱导克林霉素耐药的筛选有高的准确性，AES对苯唑西林、克林霉素的修正结果可以有效避免抗菌药物的错误选择，存在很好的可靠性，且实现了自动化，是微生物日常工作中理想的检测工具。但由于本研究纳入的菌株数量较少，只对部分抗菌药物进行评估，结果存在一定的局限性，为使研究结果更加准确可靠，有待增加菌株和抗菌药物以作进一步研究。