HPLC波长切换法同时测定红金消结片中4种成分

2023-08-08韦有华韦静

中国卫生标准管理 2023年13期

韦有华韦静

红金消结片由三七、香附、八角莲、鼠妇虫、黑蚂蚁等10味药组成，具有疏肝理气、消肿止痛、软坚散结以及活血化瘀等特点，主要用于治疗气滞血瘀引发的子宫肌瘤、乳腺小叶增生以及卵巢囊肿等病症[1-2]。方中八角莲属于小檗科植物六角莲或者八角莲等多种植物根茎，被国家药监部门命名为二级保护植物，也被称为鬼臼[3-4]，属于民间比较常见的一种中药材，被多地中药材标准收载[5]。其主要有效成分为木质素类物质4’-去甲基鬼臼毒素和鬼臼毒素以及黄酮类物质槲皮素和山柰素等。现代药理研究表明，八角莲的有效成分具有抗肿瘤、抗病毒等作用，在心血管系统和内分泌系统方面具有明显的药理作用[6]。因此，对红金消结片中八角莲进行质量控制非常必要，而目前尚未见有对此中成药中八角莲含量测定的报道。本研究采用高效液相色谱波长切换法（high Performance liquid chromatography， HPLC）同时测定此4种有效成分，创建质量标准，为红金消结片质量的有效控制提供重要依据，报道如下。

1 仪器与材料

1.1 仪器

实验所用以期为高效液相色谱仪，型号为Agilent 1260，其中包括瑞士Mettler Toledo公司公司生产的XS205型电子分析天平；美国Agilent公司生产的二极管阵列检测器；电热恒温水浴锅（北京市永光明医疗仪器有限公司）；Milli-Q超纯水机。

1.2 药品与试剂

4’-去甲基鬼臼毒素（批号111792-200901，供含量测定用，含量以99.2%计），鬼臼毒素（批号111645-201803，供含量测定用，含量以99.6%计），槲皮素（批号100081-201610，供含量测定用，含量以99.1%计），山柰素（批号110861-202013，供含量测定用，以93.2%作为含量标准，所有试剂都选自我国食品药品检定研究院，所用水选择超纯水，而甲醇则选择默克公司生产的色谱纯，剩余试剂选择分析纯；红金消结片（9批次，山东绿茵药业有限公司提供）。

2 方法与结果

本研究符合《中华人民共和国药典》所规定的标准[7]。

2.1 色谱条件

色谱柱为 Agilent ZORBAX SB-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），甲醇（A）-0.1%磷酸溶液（B）为流动相，梯度洗脱（25～30 min，A55%→45%；0～25 min，A45%→55%），流速为1.0 mL/min，柱温为30 ℃，检测波长为290 nm（0～15 min， 18～23 min）和360 nm （15～18 min，23～30 min），进样量10μL，见表1。

表1 色谱仪工作条件

2.2 溶液的制备

对照品溶液：精密称取4’-去甲基鬼臼毒素24.98 mg、槲皮素21.39 mg、鬼臼毒素21.51 mg、山柰素29.37 mg，将中药方剂分别放在50 mL的量瓶内，加如乙醇（浓度为40%）溶解，且稀释到刻度，充分摇匀，将其当作各对照品的储备液。分别对各个对照品储备液精密量取8、5、8、4 mL置同一200 mL量瓶中，加40%乙醇稀释至刻度，摇匀，将其当作对照品溶液，以备对比使用。

供试品溶液：选取20片供试品，将供试品的包衣去除，精密称定，研磨后精密称取1 g，将研磨后的供试品放在锥形瓶内，精密加入25 L乙醇（浓度为40%），称定重量，进行1 h的加热回流后取出，冷却到室温，通过乙醇（浓度为40%）补足减失的重量，充分摇匀，取续滤液。

阴性溶液：按红金消结片处方和制法制备缺八角莲的阴性样品，根据制备供试品溶液方式进行阴性溶液的制备。

2.3 方法学考察

系统适用性试验：取10 μL对照品溶液、10 μL供试品溶液以及10 μL阴性溶液，根据“2.1”所述色谱条件实施进样测定，彻底分离各检测成分和邻近成分，保证阴性溶液不会彼此影响，理论塔板数在10 000以上。图1为高效液相色谱图。

图1 高效液相色谱图

考察线性关系：分别精密吸取对照品溶液2、5、8、10、15 μL以及20 μL，根据“2.1”所述色谱条件实施进样测定，将进样量（X）当作横坐标，纵坐标为峰面积（Y），进行标准曲线的绘制，同时计算回归方程，表2为各成分回归方程和线性关系。

表2 4种成分的线性关系考察结果（n=6）

精密度试验：对10 μL对照品溶液进行精密吸取，连续6次进样，详实记录溶液峰面积，试验结果显示，槲皮素、鬼臼毒素、山柰素以及4’-去甲基鬼臼毒素的RSD值分别是0.93%、1.04%、0.98%以及1.06%（n=6），表明仪器精密度良好。

重复性试验：取同一批号的红金消结片（137191206）6份，根据“2.2”所述供试品溶液制备方式制备供试品溶液，通过色谱条件进样10 μL并展开分析，详实记录峰面积，计算其含量，结果红金消结片中4’-去甲基鬼臼毒素、槲皮素、鬼臼毒素、山柰素的含量平均值分别为149.72、12.61、309.30、16.45 μg/片，RSD值分别为1.16%、0.99%、1.27%、1.01%（n=6），表明该方法重复性良好。

稳定性试验：取同一批红金消结片（137191206）供试品，根据“2.1”所述色谱条件，分别在0、1、2、4、8、12 h以及24 h展开进样1 μL和分析，结果4’-去甲基鬼臼毒素、槲皮素、鬼臼毒素、山柰素的峰面积的RSD分别为0.89%、1.41%、1.13%、1.27%（n=7），说明24 h的样品溶液呈现稳定状态。

加样回收率试验：取含量已知样品溶液（137191206），精密加入4’-去甲基鬼臼毒素、槲皮素、鬼臼毒素、山柰素对照品适量，按“2.2”项下的供试品溶液制备标准，进行供试品溶液的制备，根据“2.1”所述色谱条件展开进样测定，并对其回收率进行计算，试验结果见表3。

表3 加样回收率试验数据（n=6）

2.4 样品含量测定

取9批样品，按“2.2”所述制备供试品溶液方法，平行制备供试品溶液2份，同时根据“2.1”所述色谱条件进行进样测定，按外标法计算，4’-去甲基鬼臼毒素、槲皮素、鬼臼毒素、山柰素的含量结果见表4。

表4 9批样品含量测定结果（μg/片，n=2）

3 讨论

俄国植物学家Tswett于100多年前首次提出并使用色谱法将植物色素的石油醚提取液中的各色素组分互相分离形成各种不同颜色的谱带[8]。色谱法的主要工作原理是溶于流动相中的混合物经过固定相时，因各组分在不同的两相中溶解、分配、吸附等化学作用性能不同，固定相内有着不同的滞留时间先后自固定相内缓慢流出，从而实现彼此分离，其核心为分离分析方法[9]。从根本上说，HPLC是基于经典液相色谱法，在60年代后期借助气相色谱理论所发展形成的，HPLC和经典液相色谱法主要差异性在于其填料颗粒比较均匀，而且较小，小颗粒存在高柱效特性，会形成高阻力，必须应用高压输送流动相，所以也被叫作高压液相色谱，由于其分析速度比较快，因此也叫高速液相色谱[10]。HPLC具有高压、高效、高速、高灵敏度、高选择性等特点，其主要由溶剂输送系统（如高压泵、脱气机等）、分离系统（如色谱柱等）、进样系统（如定量泵、定量环、六通阀以及进样针等）、检测系统（如检测器等）、记录及数据处理系统构成[11]。文献中，HPLC被广泛运用于中成药物的成分含量的测定，且其测量方法准确、灵敏度高、分离效果好。因此，本研究选择HPLC对红金消结片中4’-去甲基鬼臼毒素、槲皮素、鬼臼毒素和山柰素的含量进行测定，为更好地控制红金消结片质量提供依据。本研究采用HPLC同时测定红金消结片中4’-去甲基鬼臼毒素、槲皮素、鬼臼毒素和山柰素含量。色谱柱为 Agilent ZORBAX SB-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），甲醇（A）-0.1%磷酸溶液（B）为流动相，梯度洗脱（25～30 min，A55%→45%； 0～25 min，A45%→55%），流速为1.0 mL/min，柱温为30℃，检测波长为290 nm （0～15 min， 18～23 min）和360 nm（15～18 min， 23～30 min），进样量10 μL。本文展开了稳定性试验、精密度重复性试验、加样回收率试验和样品含量测定，发现精密度和重复性良好，样品溶液在24 h内稳定，表明该方法处理条件快速、简单，重复性良好且准确可靠，可为其质量控制提供科学依据。

色谱条件、流动相、波长和提取方法的选择对实验结果起着非常关键的作用，本研究在查阅文献的基础上，选择了恰当的参数，特报道如下。

3.1 流动相的选择

HPLC流动相的选择需要注意：（1）为了避免由于痕量杂质的积累而造成柱体损伤，并增大检测器的噪音，应尽可能使用高纯的药剂作流动相。（2）应当防止由于流动相和固定相之间的反应导致柱效率降低，或造成柱的损伤。（3）试样在流动相中必须具有合适的溶解性，以免在色谱柱中发生沉淀。（4）所述的流动相也必须符合所述探测器的条件。（5）在采用紫外线检测器时，不能对该流动相产生强烈的紫外线吸收，一般检测波长应大于流动相的截止波长。经查阅文献，HPLC常用的流动有甲醇-0.1%磷酸溶液、甲醇-0.1 mol/L磷酸二氢钾溶液、甲醇-0.1%磷酸溶液，都是等度比例[12]。经本研究前期预试验发现，甲醇-0.1%磷酸溶液的梯度洗脱，能更好地分离4种成分。因此，本研究选择甲醇-0.1%磷酸溶液作为流动相，并进行梯度洗脱作为检测条件。

3.2 波长的选择

HPLC波长的选择必须考虑被测物和各杂质在检测波长下的校正因子（f）是否相同，应对浓度相同的被测物和各杂质溶液进行分别制备，通过紫外扫描后，以接近吸光度的波长当作检测波长[13-14]。经查阅文献，八角莲中的木脂素类成分4’-去甲基鬼臼毒素和鬼臼毒素在290 nm处有最大吸收，而黄酮类成分槲皮素和山柰素在360 nm处有最大吸收，因此选择此两个波长作为检查波长[15-16]。在该检测波长下，分别进样测定，由各峰面积计算校正因子，f值为0.92，表明被测物与各杂质的f相同，可消除f的影响。同时，在本研究的试验条件下，实现了切换波长梯度洗脱同时检测4种成分，并且待测物质色谱峰与相邻色谱峰之间的分离度应＞1.5，表明达到了很好的分离效果。