杜仲调控miR-127-5p对骨关节炎软骨细胞增殖、凋亡及炎症因子的影响

刘元豪 邢忠 许环顺 肖平

(海口市第三人民医院骨科,海南 海口 571100)

骨关节炎是临床常见的一种渐进性、退行性关节病变,其发病机制尚未阐明。目前研究发现软骨细胞损伤是破坏软骨组织的重要原因之一,炎症与细胞凋亡等均可能造成软骨细胞损伤。既往研究显示植物提取物具有抗炎、抗氧化等作用,并可减轻软骨细胞炎症损伤,但其相关作用机制还不明确〔1～4〕。杜仲具有抗氧化、抑菌等作用,树皮是主要用药部位,研究表明杜仲可明显抑制促炎细胞因子表达从而抑制气道变应性炎症〔5〕。miR-127-5p在骨关节炎软骨细胞中呈低表达,上调其表达可通过靶向调控脂联素(adipo)R1从而促进软骨细胞增殖及抑制炎症反应〔6〕。杜仲能否通过调控miR-127-5p发挥作用尚未可知。本研究探讨杜仲调控miR-127-5p对人骨关节炎软骨细胞HC-OA凋亡、增殖、细胞周期、炎症反应的影响。

1 材料与方法

1.1材料与试剂 杜仲购自亳州市亿弘堂药业有限公司;人骨关节炎软骨细胞HC-OA购自北京科瑞思博生物技术有限公司;DMEM培养基购自美国Gibco;白细胞介素(IL)-1β购自美国Sigma;Lipofectamine2000、Trizol试剂购自美国Invitrogen;anti-miR-NC、miR-127-5p inhibitor购自广州锐博生物科技有限公司;反转录与荧光定量PCR试剂购自北京天根生化科技有限公司;噻唑蓝(MTT)试剂、凋亡检测试剂购自北京索莱宝科技有限公司;IL-6、IL-1β检测试剂盒购自上海酶联生物科技有限公司。

1.2实验分组 杜仲水提物制备〔7〕:称取杜仲100 g,研磨成粉后加入70%乙醇(8倍量),加热回流提取后减压浓缩后干燥备用,浓度为10 g/ml,分别稀释为0.01、0.10、1.00 mg/ml。HC-OA细胞调整浓度为1×105个/ml,将其接种于96孔板,每孔100 μl,添加IL-1β(10 ng/ml)培养24 h〔8〕,标记为IL-1β组;将常规培养的HC-OA细胞标记为Con组。添加含不同浓度(0.01、0.10、1.00 mg/ml)的杜仲培养液与10 ng/ml IL-1β培养24 h,分别为IL-1β+杜仲低剂量组、IL-1β+杜仲中剂量组、IL-1β+杜仲高剂量组。miR-127-5p inhibitor、anti-miR-NC转染至HC-OA细胞后添加含1 mg/ml杜仲培养液培养24 h,依次为杜仲高剂量+miR-127-5p inhibitor组、杜仲高剂量+anti-miR-NC组。

1.3MTT检测HC-OA细胞增殖 收集各组HC-OA细胞,加入20 μl MTT溶液,室温培养4 h,3 000 r/min离心5 min,弃上清,加入150 μl 二甲基亚砜(DMSO),5 min后用酶标仪测定490 nm处吸光度值(OD),并计算增殖抑制率〔(对照组OD-实验组OD)/(对照组OD-空白组OD)×100%〕。

1.4细胞周期测定 收集各组HC-OA细胞,加入预冷磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤后加入预冷PBS重悬细胞(500 μl),加入预冷70%乙醇(3.5 ml),充分混匀后放入4 ℃冰箱内过夜,3 000 r/min离心弃上清,PBS洗涤后,向细胞沉淀中加入50 μl RNaseA,37 ℃水浴30 min后加入碘化丙啶(PI)染色液450 μl,4 ℃孵育30 min后上机检测各阶段细胞比例。

1.5流式细胞术测定HC-OA细胞凋亡率 向各组HC-OA细胞中添加预冷PBS,洗涤后弃上清,添加结合缓冲液500 μl重悬细胞,分别加入5 μl膜联蛋白(Annexin) Ⅴ-FITC、PI,室温孵育10 min,上荧光激活细胞分选(FACS)Calibur流式细胞仪检测测定HC-OA细胞凋亡率。

1.6实时荧光定量(qRT)-聚合酶链反应(PCR)测定miR-127-5p水平 Trizol法从各组HC-OA细胞中提取总RNA,检测RNA浓度后,反转录成cDNA,反应条件:42 ℃ 15 min,95 ℃ 3 min,cDNA置于-20 ℃冰箱内保存。cDNA稀释20倍后进行qRT-PCR。应用荧光定量PCR仪(罗氏LightCycler480)检测miR-127-5p水平。

1.7酶联免疫吸附试验(ELISA)检测IL-6、IL-1β水平 收集各组HC-OA细胞上清液,严格按照ELISA试剂盒的说明检测IL-6、IL-1β的水平。

1.8统计学分析 采用SPSS21.0软件采用独立样本t检验和单因素方差分析。

2 结 果

2.1杜仲对HC-OA增殖的影响 与Con组比较,IL-1β组细胞存活率降低,G0-G1期细胞比例降低,S期细胞比例升高;与IL-1β组比较,IL-1β+杜仲中剂量组、IL-1β+杜仲高剂量组细胞增殖存活率升高,G0-G1期细胞比例升高,S期细胞比例降低,差异均有统计学意义,且呈剂量依赖性(均P<0.05),见表1。

表1 杜仲对HC-OA存活率、细胞周期的影响

2.2杜仲对HC-OA凋亡及miR-127-5p表达的影响 与Con组比较,IL-1β组细胞凋亡率升高,miR-127-5p表达降低;与IL-1β组比较,IL-1β+杜仲中剂量组、IL-1β+杜仲高剂量组细胞凋亡率下降,miR-127-5p表达升高,差异均有统计学意义,且呈剂量依赖性(P<0.05),见图1、表2。

图1 杜仲对IL-1β诱导的软骨细胞凋亡的影响

表2 杜仲对HC-OA凋亡、miR-127-5p及炎症因子表达的影响

2.3杜仲对HC-OA中炎症因子水平的影响 与Con组比较,IL-1β组IL-6、IL-1β水平明显增加;与IL-1β组比较,IL-1β+杜仲中剂量组、IL-1β+杜仲高剂量组上述指标的水平明显降低(P<0.05),见表2。

2.4抑制miR-127-5p对杜仲作用的HC-OA增殖、凋亡的影响 与杜仲高剂量+anti-miR-NC组比较,杜仲高剂量+miR-127-5p inhibitor组细胞增殖存活率和G0-G1期细胞比例显著降低,S期细胞比例和凋亡率显著增高(P<0.05),见图2、表3。

图2 抑制miR-127-5p对杜仲作用的软骨细胞凋亡的影响

表3 抑制miR-127-5p对杜仲作用的HC-OA抑制率、细胞周期、凋亡及炎症因子表达的影响

2.5抑制miR-127-5p对杜仲作用的HC-OA中炎症因子表达的影响 与杜仲高剂量+anti-miR-NC组比较,杜仲高剂量+miR-127-5p inhibitor组IL-6、IL-1β水平显著升高(P<0.05),见表3。

3 讨 论

骨关节炎是一种致残率较高的疾病,临床主要采用西药等方法进行治疗,但西药具有不良反应且部分患者对药物易产生耐药性,传统中药在治疗骨关节炎方面可发挥重要作用,甘草素、黄芩素、牛膝醇提物等均可影响关节炎软骨细胞凋亡、增殖等生物学行为〔9～11〕。

杜仲具有强筋骨、补肝肾等作用,其在治疗骨关节炎方面作用重大,但其调控机制仍不明确〔12～14〕。本研究提示杜仲可抑制骨关节炎软骨细胞增殖,并可诱导细胞周期阻滞于G0-G1期。本研究提示杜仲可促进骨关节炎软骨细胞凋亡。IL-6、IL-1β属于促炎因子,其在软骨细胞中的水平升高可加重细胞炎症损伤〔15,16〕。本研究提示杜仲可降低骨关节炎软骨细胞炎症反应的发生。

circRNA.33186通过充当miR-127-5p的海绵分子促进骨关节炎的发生〔17〕。circ_0136474、MMP-13通过与miR-127-5p竞争性结合来而抑制骨关节炎中的软骨细胞增殖〔18〕。miR-127-5p调节骨桥蛋白的表达而介导人软骨细胞增殖〔19〕。本研究提示杜仲可能通过提高miR-127-5p表达影响细胞进展。阻碍miR-127-5p表达可明显逆转杜仲对骨关节炎软骨细胞周期、凋亡、增殖及炎症反应的影响。