地佐辛对多发性脑梗死大鼠星形胶质细胞活性及TLR4/NF-κB信号通路的影响

高文勇 吴琼莹 艾艳萍 李姣 魏海棠

(武汉市汉口医院 1神经内科,湖北 武汉 430012;2康复医学科)

多发性脑梗死(MCI)是指脑内有多个因缺血而产生的软化病死灶,又称为多发性脑软化,可导致患者产生瘫痪、语言障碍、认知障碍、痴呆等不良症状,对患者的生命安全及生活质量造成不良影响,胶质细胞、神经细胞等脑组织内的炎症反应是脑梗死期间脑损伤的主要原因之一〔1,2〕。星形胶质细胞是中枢神经系统中主要的大胶质细胞,对脑发育及神经功能至关重要,脑梗死时星形胶质细胞会发生细胞变性、增殖增强等一系列的病理反应,进而加剧脑损伤〔3,4〕。Toll样受体(TLR)4是天然免疫受体,可激活核转录因子(NF)-κB通路,诱导肿瘤坏死因子(TNF)-α等炎症因子的表达,在脑缺血再灌注大鼠炎症反应中发挥促进作用〔5,6〕。因此探究具有抑制星形胶质细胞活性、脑组织炎症反应的药物对于治疗MCI具有积极作用。地佐辛是一种阿片受体激动、拮抗剂,主要用于术后镇痛、消炎等,对乳腺癌改良术后炎症介质、应激反应具有一定的抑制作用〔7〕,对局灶性脑缺血再灌注大鼠神经功能、脑损伤等具有一定的保护作用〔8〕,对大鼠皮层星形胶质细胞活性及迁移能力具有一定的抑制作用〔9〕,因此本研究通过探究地佐辛对MCI大鼠星形胶质细胞活性及TLR4/NF-κB通路的影响。

1 资料与方法

1.1动物 40只SD雄性大鼠(北京维通利华实验动物技术有限公司),SPF级,生产许可证号为SCXK(京)2016-0011,体质量250～300 g。所有大鼠于武汉市汉口医院动物房中饲养,12 h昼夜交替,自由饮食、饮水,温度约25 ℃,相对湿度约50%,保持动物房环境及鼠笼清洁、透气。在实验过程中按照动物使用的“3R”原则给予人道主义关怀。本研究经动物伦理委员会批准同意。

1.2主要试剂及仪器 地佐辛、尼莫地平(CAS号:53648-55-8、66085-59-4)购于上海源叶生物科技有限公司;海藻酸钠微球血管栓塞剂(北京圣医耀科技发展有限责任公司);大鼠TNF-α、白细胞介素(IL)-1β、IL-6酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(货号:ml002859、ml037361、ml102828)购于上海酶联生物科技有限公司;苏木素-伊红(HE)染色试剂盒、RIPA组织裂解液、二喹啉甲酸(BCA)蛋白试剂盒(货号:G1120、R0020、PC0020)购于北京索莱宝科技有限公司;兔源神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、TLR4、髓样分化因子(MyD)88、NF-κB、β-actin抗体(货号:ab7260、ab217274、ab219413、ab220803、ab8227)购于Abcam公司;低温高速离心机(美国Sigma公司);包埋机、切片机、染色机、封片机(德国Leica公司);正置荧光显微镜、光学显微镜(日本OLYMPUS公司);恒温水浴箱(上海博讯有限公司);酶标仪(美国Thermo公司);蛋白电泳仪、转膜仪(美国Bio-Rad公司)。

1.3动物模型制备及分组给药 50只SD大鼠随机分为假手术组(8只)、MCI造模组(32只),MCI大鼠模型的构建参考文献〔10〕中的微球法,将大鼠持仰卧位固定,腹腔注射3.5%的水合氯醛麻醉大鼠,颈部皮肤常规消毒,于颈部正中做切口,暴露并分离颈总动脉、颈内动脉、颈外动脉,结扎大鼠颈外动脉远心端,夹闭颈总动脉,用注射器由外动脉向内动脉注射0.1 ml的海藻酸钠微球血管栓塞剂,使栓塞剂由动脉到达脑内动脉,形成多发性脑梗死,松开动脉夹,结扎颈外动脉近心端,缝合伤口回笼饲养,假手术组由0.1 ml的0.9%氯化钠注射液代替栓塞剂,其余操作相同。大鼠苏醒后对其进行神经功能缺损评分,分数为1～3分认为MCI大鼠造模成功。造模期间出现大鼠死亡或不符合条件的现象,及时选取备用大鼠进行MCI模型的构建。

将造模成功的MCI大鼠随机分为模型组、地佐辛低剂量组(尾静脉注射地佐辛,5 mg/kg)、地佐辛高剂量组(尾静脉注射地佐辛,10 mg/kg)〔8〕、尼莫地平组(尾静脉注射尼莫地平2 mg/kg)〔11〕,每组8只,按照各组给药剂量进行给药处理,连续14 d。

1.4各组神经功能缺损评分 在给药第0、7、14天进行神经功能缺损评分,评分标准参考〔12〕,0分:无神经功能缺损症状,1分:不能完全伸展左侧前爪等轻微神经功能缺损症状,2分:向一侧转圈等中度神经功能缺损症状,3分:向一侧倾倒等重度神经功能缺损症状,4分:完全不能行走、意识障碍。

1.5各组脑组织HE染色观察 将大鼠麻醉处死后取脑组织,每组取3只大鼠脑组织,修剪合适后于组织脱水机中脱水透明处理,将处理过的脑组织包埋于融化的石蜡中,待其凝固后切成厚约4 μm的切片,60 ℃烤片后采用HE染色试剂盒对大鼠脑组织进行HE染色处理,具体操作参考试剂盒中的说明书,封片后于显微镜下观察。

1.6各组大鼠脑组织中星形胶质细胞活性测定 星形胶质细胞超微结构观察:取1.5中剩余大鼠脑梗死组织适量(体积约为1 mm3),于4%戊二醛中固定1 h,经磷酸盐缓冲液(PBS)清洗后用锇酸固定2.5 h,用PBS清洗,经梯度乙醇脱水处理,用环氧树脂包埋后切成厚度约为60 nm的薄片,经柠檬酸铅、醋酸铀染色后电镜下观察星形胶质细胞形态。

免疫组化法检测星形胶质细胞标志物GFAP活性:取大鼠脑组织常规石蜡切片,60 ℃烘片6 h,经滴度乙醇脱蜡至水,用柠檬酸盐缓冲液进行抗原修复,用PBS冲洗3次后滴加10%血清进行封闭处理,加入兔源GFAP抗体,4 ℃过夜,37 ℃复温,加入羊抗兔二抗,经过二氨基联苯胺(DAB)显色、PBS冲洗后封片、观察。

1.7各组脑组织中炎症因子水平测定 取剩余5只大鼠脑组织适量,加入适量生理盐水用匀浆机制成脑组织匀浆,离心取上清液,根据TNF-α、IL-1β、IL-6 ELISA试剂盒说明书进行炎症因子水平的测定。

1.8各组脑组织TLR4/NF-κB通路相关蛋白表达检测 取大鼠脑组织适量,用RIPA组织裂解液提取脑组织中总蛋白质,离心取上清液,用BCA试剂盒测定其中蛋白质水平,将脑组织用蛋白上样液调至相同浓度,高温加热变性,采用电泳实验分离蛋白,将分离的蛋白经湿转法转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上,加入8%的脱脂奶扥封闭处理,分别加入兔源TLR4(1∶200)、MyD88(1∶200)、NF-κB(1∶200)、β-actin(1∶5 000)一抗,4 ℃过夜,用TBST漂洗3次,加入辣根过氧化物酶标记的相应二抗,室温孵育1 h,经过显色、定影后观察并分析。

1.9统计学分析 采用GraphPad Prism8软件进行方差分析,两组间比较行LSD-t检验。

2 结 果

2.1各组神经功能缺损评分比较 给药第0、7、14天,与假手术组相比,其余各组神经功能缺损评分显著升高(P<0.05);给药第7、14天,与模型组相比,地佐辛各剂量组及尼莫地平组神经功能缺损评分显著降低(P<0.05),且有一定的剂量依赖效应,与地佐辛各剂量组相比,尼莫地平组神经功能缺损评分明显降低(P<0.05)。见表1。

表1 各组不同给药时间神经功能缺损评分分)

2.2各组脑组织 假手术组脑组织无明显病变,形态基本正常,神经细胞结构清晰,核仁核膜等结构基本正常;模型组脑组织病变明显,神经细胞排列疏松,出现严重肿胀、空泡化等现象;与模型组相比,地佐辛各剂量组及尼莫地平组脑组织神经细胞结构得到一定缓解,其中尼莫地平效果较好。见图1。

图1 各组脑组织(HE染色,×200)

2.3各组脑组织星形胶质细胞超微结构及GFAP活性测定 假手术组脑组织中星形胶质细胞结构正常,细胞器正常,脑组织中GFAP蛋白表达(0.23±0.03)显著较低;与假手术组相比,模型组脑组织中星形胶质细胞结构异常,出现严重肿胀、细胞核染色加深等不良表现,脑组织中GFAP蛋白表达(0.67±0.06)显著升高(P<0.05);与模型组相比,地佐辛低、高剂量组、尼莫地平组脑组织中星形胶质细胞结构得到一定缓解,脑组织中GFAP蛋白表达(0.29±0.04、0.23±0.03、0.11±0.02)显著降低(P<0.05),其中尼莫地平效果较好。见图2、图3。

图3 各组脑组织GFAP蛋白表达(免疫组化染色,×200)

2.4各组脑组织炎症因子水平比较 与假手术组相比,模型组、地佐辛低、高剂量组、尼莫地平组脑组织中TNF-α、IL-1β、IL-6水平显著升高(P<0.05);与模型组相比,地佐辛各剂量组大鼠脑组织中TNF-α、IL-1β、IL-6水平显著降低(P<0.05),且呈现一定的剂量效应关系;与地佐辛各剂量组相比,尼莫地平组脑组织中TNF-α、IL-1β、IL-6水平明显降低(P<0.05)。见表2。

表2 各组脑组织炎症因子水平及TLR4/NF-κB通路蛋白表达比较

2.5各组脑组织TLR4/NF-κB通路蛋白表达比较 与假手术组相比,模型组、地佐辛低、高剂量组、尼莫地平组脑组织中TLR4、MyD88、NF-κB蛋白表达显著升高(P<0.05);与模型组相比,地佐辛各剂量组脑组织中TLR4、MyD88、NF-κB蛋白表达显著降低(P<0.05),且呈现一定的剂量效应关系;与地佐辛各剂量组相比,尼莫地平组脑组织中TLR4、MyD88、NF-κB蛋白表达明显降低(P<0.05)。见表2、图4。

1～5:正常对照组、模型组、地佐辛低剂量组、地佐辛高剂量组、尼莫地平组图4 各组脑组织TLR4/NF-κB通路蛋白表达

3 讨 论

MCI与动脉粥样硬化、动脉狭窄动脉硬化斑块脱落等多种疾病密切相关,具有较高的致残率及复发率,严重影响患者生活质量〔13〕。脑缺血后炎症反应是加剧神经功能、脑细胞受损的重要病理环节之一,脑坏死区域TNF-α、IL-1β、IL-6等炎性因子释放、白细胞浸润、小胶质细胞及星形胶质细胞异常激活均可促进机体炎症反应,加剧脑损伤〔14,15〕。

地佐辛常用于各大手术后的镇痛,同时具有控制术后炎症反应及氧化应激反应等作用〔16〕,对于脑缺血再灌注大鼠脑损伤、神经元损伤、神经功能缺损具有一定的保护作用〔8,17〕。本研究结果提示,地佐辛具有显著改善MCI大鼠脑损伤及神经功能的作用,但其可能作用机制仍不清晰。

脑梗死后脑组织缺血坏死,脑内血管内皮细胞严重受损,受损部位会产生大量的炎性细胞因子,炎性细胞的聚集及浸润将会增加缺血区脑组织的损伤,进而造成不可逆的神经功能受损〔18〕。星形胶质细胞是中枢神经系统重要的胶质细胞,脑梗死后脑部炎症反应引起星形胶质细胞的异常激活,导致星形胶质细胞增殖能力增强、细胞肥大,活化的星形胶质细胞又会诱导小胶质细胞分化与增殖并促进TNF-α、IL-1β等炎症因子的大量释放,进而影响神经元突触重建及生长,加剧脑损伤〔19〕。GFAP是星形胶质细胞特异性标志物,测定脑组织中GFAP蛋白的表达可侧面反映星形胶质细胞活性〔20〕。TLR4/NF-κB通路是重要的炎症反应通路,在脑缺血再灌注损伤中发挥重要作用,TLR4是重要的天然免疫受体,MyD88为TLR4通路重要的衔接分子,脑损伤后TLR4可诱导NF-κB激活,进而促进脑组织炎症因子释放,从而加剧脑损伤,抑制TLR4/NF-κB通路的激活对于抑制脑缺血再灌注损伤大鼠炎症反应、改善神经功能具有积极的促进作用〔21～23〕。本研究结果提示,地佐辛可显著降低MCI大鼠脑部炎症反应及星形胶质细胞活性,对TLR4/NF-κB通路具有一定的抑制作用。