基于矿质元素指纹的荞麦产地溯源研究

张玉芬 齐景凯 王桂玲 赵宝平 周磊

（1 内蒙古民族大学生命科学学院，028043，内蒙古通辽；2 扎兰屯市绿色产业发展中心，162650，内蒙古扎兰屯；3 内蒙古农业大学农学院，010019，内蒙古呼和浩特；4 内蒙古民族大学农学院，028043，内蒙古通辽）

荞麦（Fagopyrum esculentumMoench.）是蓼科（Polygonaceae）荞麦属（Fagopyrum）一年生植物，又名净肠草、乌麦或三角麦[1-2]。荞麦营养全面，含有丰富的维生素、氨基酸、膳食纤维和微量元素等营养物质，而且富含生物类黄酮、糖醇和D-手性肌醇等高活性药用成分，具有消炎、降脂、降糖、降胆固醇、抗氧化、抗衰老和清除自由基的功能[3-4]，是良好的药食同源作物。不同产地荞麦微量元素和活性成分不同，有研究[5]表明，内蒙古通辽市库伦旗荞麦中钙含量是内蒙古包头市固阳县荞麦中钙含量的2.12 倍，而包头市固阳县荞麦中铯含量是库伦旗的4.35 倍。目前对荞麦的研究多集中在通过对有机活性成分如蛋白质、氨基酸、总黄酮、芦丁等的测定[6-7]来判定产地来源，但生物有机活性成分受储藏时间的影响较大，而生物矿质元素不能自身合成，必须从外界环境中获得，且一旦获得就不受储藏条件等外界因素的影响，因而矿质元素建立的指纹图谱更能真实、稳定反映农产品的地理信息。矿质元素指纹分析在中药材中应用广泛[8-10]。冯利芳等[5]对内蒙古产区荞麦中27 种矿物质元素进行了测定和特征分析；Zhang 等[11]对内蒙古、山西和陕西3 个产区荞麦中矿质元素、氨基酸和维生素进行了多元溯源分析。逐步判别分析被成功应用于所建立的中药材矿质元素指纹图谱判断产地来源的最佳判别变量，留一法交叉验证的正确判别率也很高[12-14]。

因此，本研究采用微波消解原子吸收法和电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS 法）同时测定了吉林、内蒙古东部、内蒙古西部、陕西、甘肃、四川、贵州和云南8 个地区所产荞麦中的常量元素钠（Na）、镁（Mg）、钾（K）、钙（Ca），微量元素：钒（V）、铬（Cr）、锰（Mn）、铁（Fe）、钴（Co）、镍（Ni）、铜Cu）、锌（Zn）、硒（Se）、锶（Sr）、铷（Rb）、铯（Cs）、钡（Ba）和有害元素砷（As）、镉（Cd）和铅（Pb）的含量，并采用相关性分析、显著性分析和主成分分析筛选出影响荞麦产地的主要矿质元素；经聚类分析和判别分析对不同产地荞麦进行分类；经交叉检验和回代检验进行荞麦产地的验证，为荞麦产地鉴别提供方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

供试材料为60 份荞麦样品，其中通辽市农业科学院提供的10 份产自内蒙古通辽市（东部）（编号1～10），内蒙古农业科学院提供的10 份产自内蒙古西部（编号11～20），吉林白城市农业科学院提供的8 份产自吉林省（编号21～28），云南省农业科学院提供的16 份中，6 份产自贵州省（编号29～34）、5 份产自云南省（编号35～39）、5 份产自四川省（编号40～44），其余16 份产自陕西省（编号45～52）和甘肃省（编号53～60），各8 份。因为内蒙古东、西部地理纬度跨度较大，所以将产自内蒙古的荞麦分为东部和西部进行产地溯源研究。

试剂包括硝酸（优级纯，65%）和过氧化氢（优级纯，30%），均购自南京化学试剂有限公司，标准溶液为10mg/LNa、Mg、K、Ca、V、Cr、Mn、Fe、Co、Ni、Cu、Zn、As、Se、Rb、Sr、Cd、Cs、Ba、Pb 元素的混合溶液（批号N9300233，PerkinElmer），调谐液为1μg/L 的Ce、Co、Li、Mg、In、U 混合元素（N814501，PerkinElmer），高纯氩气（纯度99.999%，通辽市朗月化工有限责任公司）。

1.2 试验仪器

配备四级杆质量过滤器的350Q 型电感耦合等离子体质谱仪（PerkinElmer）；配有聚四氟乙烯罐的ETHOS UP 型微波辅助萃取系统（Milestone）Milli-Q®型水净化系统（Millipore）；FA1004N 电子天平（上海精密科学仪器公司）；FX101-3 干燥箱（上海一恒公司）；质控样GBW(E)100380（玉米粉中Pb、Cd、As 成分分析标准物质）购自于国家标准物质中心。

1.3 测定指标与方法

参照GB 5009.91-2017[15]第一法测定荞麦中常量元素K 和Na；参照GB 5009.92-2016[16]第一法测定荞麦常量元素Ca；参照GB 5009.241-2017[17]第一法测定荞麦中常量元素Mg；参照GB 5009.268-2016[18]中第一法测定荞麦中微量元素V、Cr、Mn、Fe、Co、Ni、Cu、Zn、Se、Rb、Sr、Cs、Ba、As、Pb、Cd。

1.4 数据处理

利用SPSS 22.0 软件进行正态分布分析、相关性分析、主成分分析、判别分析和聚类分析。

2 结果与分析

2.1 校准曲线和线性范围

由表1 可知，所有元素的相关系数（r）≥0.9991，线性关系良好；所有被测元素的相对标准偏差（RSD 值）均未超过3.58%；各元素的回收率在95.37%～104.03%；LOD 为0.02～1.25ng/L，LOQ在0.06～3.75ng/L。

表1 20 种元素的回归方程、相关系数、平均回收率、相对标准偏差、定量限和检测限Table 1 Regression equation,correlation coefficient,the average recovery rates,RSD,LOD and LOQ of 20 elements

2.2 荞麦中矿质元素含量特征

表2 表明，不同产地荞麦中Mg、K、Ca、Fe、Mn、Zn、Ni、Rb、Sr 元素的含量呈正态分布，其余元素含量不符合正态分布。荞麦中常量元素的含量顺序是K＞Mg＞Na＞Ca，微量元素含量表现为Mn＞Fe＞Rb＞Zn＞Cu＞Ni＞Sr＞Ba＞Cr＞Co＞Cs＞V＞Se，重金属元素含量表现为As＞Pb＞Cd。从表2 中可知，Co、V、Pb、Cd 和As 的变异系数均超过了100%，说明不同产地荞麦中矿质元素含量有较大的差异。

表2 荞麦中矿质元素含量Table 2 Contents of mineral elements in buckwheat

由表3 可知，荞麦中的Na 与K、Zn、Se、Rb呈极显著正相关，与Ni 呈显著正相关；Mg 与Cd呈显著正相关；Fe 与Mn、Pb 呈极显著正相关，与Co 呈显著相关，与Cr、V、Rb 呈显著负相关；Mn与Co 呈显著正相关，与Rb 呈显著负相关；Cu 与Cd、As 呈显著正相关；Zn 与As 呈显著正相关，与Se 呈显著负相关；N 与Rb、Cs 呈极显著正相关，与Cd 呈显著负相关；Cr 与V、Sr 呈显著正相关；Co 与Pb 呈极显著正相关，与As 呈显著正相关；V 与Sr、Ba 呈极显著正相关；Sr 与Ba 呈显著正相关；Pb 与As 呈显著正相关；Cd 与As 呈极显著正相关。以上结果说明荞麦中矿质元素之间存在协同吸收或拮抗抑制作用。

表3 荞麦不同元素的相关性分析Table 3 Correlation analysis of different elements in buckwheat

2.3 不同产地荞麦中矿质元素含量差异比较

Duncan's 多重分析结果（表4）表明，除元素V 和Cs 以外，其余元素在不同产地均存在显著性差异。内蒙古东部荞麦中Na、Se 和Rb 含量最高；贵州荞麦中Fe、Cu 和Zn 含量最高；吉林荞麦中Co 最高；内蒙古西部荞麦中Mg 含量最高；宁夏荞麦中Mn 含量最高；陕西荞麦中Sr 和Ba 含量最高；甘肃荞麦中Ca、Mn 和Ni 含量最高；云南荞麦中K 含量最高。不同产地荞麦均有其特有的矿质元素指纹信息。不同产地荞麦中重金属含量均有不同程度的超标，产自贵州、甘肃和四川的荞麦中Pb 含量均已超过我国国家标准关于谷物中Pb 限量的规定（Pb≤0.2mg/kg）[19]；产自贵州、吉林、内蒙古西部区、陕西和四川的荞麦中Cd 含量均已超过我国国家标准关于谷物中Cd 限量的规定（Cd≤0.1mg/kg）[19]；产自贵州、陕西和四川的荞麦中As 含量均已超过我国国家标准关于谷物中As 限量的规定（As≤0.5mg/kg）[19]；产自贵州和四川的荞麦中Pb、Cd 和As 均超标。

表4 不同产地荞麦中矿质元素含量差异分析Table 4 Difference analysis of mineral elements in buckwheat from different producing areasmg/kg

2.4 矿质元素指纹对荞麦产地的鉴别分析

2.4.1 主成分分析（PCA） 主成分分析是一种多变量统计方法，是最常用的降维方法之一，通过正交变换将一组可能存在相关性的变量数据转换为一组线性不相关的变量，转换后的变量被称为主成分；其目的是在“信息”损失较小的前提下，将高维的数据转换到低维，从而减小计算量[20]。Duncan's 多重分析结果（表4）表明，不同产地荞麦中V 和Cs 元素差异不显著，剔除无显著性差异（关联性差）的V 和Cs 元素，将不同产地18 种矿质元素进行主成分分析（表5），可知影响8 个不同产地荞麦中18 种元素的主成分有6 个，6 个主成分的特征值均大于2.00，累积方差贡献率为77.67%，可代表大多数样品。根据载荷占比可知，第1 主成分中Fe、Cu、Zn、Cd、Pb、As 占比较大，与显著性分析中贵州荞麦信息相符；第2 主成分中Na、Se、Rb 与显著性分析中通辽荞麦信息相符；第3 主成分中V、Sr、Ba 与显著性分析中陕西荞麦信息相符；第4 主成分中K、Ca 和Ni占比较大，与显著性分析中云南和甘肃荞麦信息相符；Mn 和Cr 在第5 主成分中载荷较大，与显著性分析中甘肃和四川荞麦信息相符；Co 在第6主成分中载荷较大，与显著性分析中吉林荞麦信息相符。因此，不同产地荞麦矿质元素分布呈现一定的规律。为便于直观分析，提取前2 个主成分得分绘制散点图（图1），其中第1 主成分占26.27%，第2 主成分占15.80%。

图1 不同产地荞麦矿质元素含量的主成分分析Fig.1 PCA of mineral element content of buckwheat from different producing areas

表5 荞麦中矿质元素含量的主成分分析Table 5 Principal component analysis of mineral elements in buckwheat

2.4.2 不同产地荞麦矿质元素的线性判别分析（linear discriminant analysis，LDA） PCA 是无监督的，降低了维数并将信息损失降到最低，用主要的特征代替其他相关的非主要特征，但映射时没有利用任何数据内部的分类信息，在分类上变得更加困难；而线性判别分析（LDA）实现了映射时低维数上的类间分开、类内集中[21]，常用的LDA 是Fisher 线性判别分析。因此，采用Fisher 线性判别函数对60 个荞麦品种进行分类分析，由图2 可知，不同产地荞麦Fisher 线性判别函数图的分布不同，其中吉林、内蒙古东部、内蒙古西部和四川所产荞麦的分布是独立的，没有与其他省区所产荞麦交叉，而甘肃和陕西所产荞麦有交叉，云南和贵州所产荞麦有交叉。

图2 不同产地荞麦的Fisher 判别函数图Fig.2 Fisher discriminant function of buckwheat from different producing areas

对荞麦中存在显著性差异的20 种矿质元素进行逐步判别分析（stestepwise linear discriminant analysis，SLDA），以进一步了解矿质元素指纹对荞麦产地的判别效果，并采用交叉验证进行检验。结果（表6）表明，回代检验和交叉验证正确判别率分别为98.3%和93.3%。

表6 不同产地荞麦逐步判别分析验证结果Table 6 Validation results of stepwise discriminant analysis of buckwheat from different producing areas

2.4.3 聚类分析 为进一步直观读出各样品的所属分类，对60 个荞麦样品进行系统聚类分析。由图3 可知，内蒙古东部和吉林所产荞麦被划分为一类，内蒙古西部、甘肃、陕西、四川、贵州和云南荞麦被划分为一类。有2 个样品被判错，陕西的4号样品被错判给甘肃，云南的5 号样品被错判给四川，准确率达96.67%。可见，矿质元素指纹结合聚类分析可以有效地对荞麦产地进行区分。

图3 不同产地荞麦矿质元素含量的系统聚类分析Fig.3 Systematic cluster analysis of mineral elements in buckwheat from different producing areas

3 讨论

许多研究表明荞麦含有丰富的矿质元素，矿质元素对人体起着重要的作用。如Cr 促进胰岛素分泌、增强胰岛素活性，起到防治糖尿病的功效[22]，V 促进动物的生长发育、增强铁对红细胞的再生作用、抑制胆固醇的合成，具有肾功能调整作用、类胰岛素样作用、骨骼和牙齿钙化作用等[23]。本研究测定了8 个地区的60 份荞麦样品中矿质元素含量，含量变化趋势表现为K＞Mg＞Na＞Ca＞Mn＞Fe＞Rb＞Zn＞Cu＞Ni＞Sr＞Ba＞Cr＞Co＞Cs＞V＞Se＞As＞Pb＞Cd；不同产地荞麦矿质元素含量差异较大，其中内蒙古东部荞麦中Na、Se 和Rb 含量最高，贵州荞麦中Fe、Cu 和Zn 含量最高，吉林荞麦中Co 含量最高，内蒙古西部荞麦中Mg 含量最高，宁夏荞麦中Mn 含量最高，陕西荞麦中Sr和Ba 含量最高，甘肃荞麦中Ca、Mn 和Ni 含量最高，云南荞麦中K 含量最高，表明不同产地荞麦拥有特有的矿质元素指纹信息。

荞麦矿质元素含量可能与土壤类型有关，本研究中吉林、内蒙古东部、内蒙古西部所产荞麦中Mn 含量相当，吉林和内蒙古东部主要土壤类型是黑钙土、草甸土和风沙土，内蒙古西部主要是潮土、栗钙土和草甸土；四川、贵州和云南中Ca 和Mn的含量相当，四川主要土壤类型是赤红壤、红壤和黄壤，云南主要是赤红壤、黄壤和红壤，贵州主要是黄壤、红壤和石灰土。

相关性分析表明，荞麦中矿质元素存在协同吸收和拮抗抑制作用。不同产地荞麦样品中仅V 和Cs 的平均含量无显著性差异，说明荞麦中V 和Cs含量与产地关联性较差，不同产地荞麦中矿质元素的主成分分析进一步表明不同产地荞麦矿质元素分布呈现一定的规律，

植物生长地区的经纬度、海拔、光照和温湿度等环境因子也是影响植物矿质元素的主要因素。顾志荣[24]研究表明，经度、纬度和海拔等地理位置是影响当归药材中无机元素含量的主要因素，当归中Fe、Mn、Mg、Na、K、Cu 含量随着海拔的升高而升高，海拔是当归中Zn、Ca、Pb、Cd、As、Cr、Sb、Ni 含量的限制因素；经度是Fe、Mg、Ca、Na、K、As、Cu、Cr、Sb、Ni 含量的主要因素，是影响当归中Zn、Mn、Pb、Cd 含量的限制因素；纬度是影响Zn、K、Cu、Cr、Sb 含量的主要因素，是影响当归中Fe、Mn、Mg、Ca、Na、Pb、Cd、As、Ni 的限制因素。本研究中陕西、甘肃和四川荞麦中Na 含量相当，原因在于它们的地理位置比较近；甘肃、四川、云南和贵州Rb 含量相当，也是它们的地理位置比较接近所致。潘美娜[25]研究表明，光质不仅影响蓝莓幼苗矿质元素的积累，也影响矿质元素在蓝莓幼苗中的分配，在红蓝光质中添加绿光能显著促进蓝莓幼苗地上部矿质元素P、K、Ca 和Fe 的积累，但抑制了蓝莓地上部Zn 的累积，红蓝光增加了N、Na 和Zn 在蓝莓叶片的分布，增加了K、Mg、Ca、P、Fe、Mn 和Cu 在根和茎的分布。

此外，Qian 等[26]研究表明，化肥对Fe、Co、Ni、Se、Rh、Eu、Pr、Tl 和Pt 元素含量有显著影响，农药对Al、Co 和Ni 元素含量影响显著。Zhao等[27]研究表明，Sr、Ba 和Na 是谷物、马铃薯和豆类3 种作物中地理溯源的良好指标。Wang 等[28]研究表明，Na、Cr、Rb、Sr、Mo、Cs、Ba 和Pb 可以作为玉米产地鉴别的特征指标，通过交叉验证获得了92.2%的正确率。本研究采用Rb、Sr、Co、Ba 和Cr 作为荞麦产地溯源的稳定有效指标。

4 结论

聚类分析和判别分析结合矿质元素指纹可以实现不同产地荞麦的分类。利用逐步判别分析筛选出Rb、Sr、Co、Ba 和Cr 5 种元素作为鉴别不同产地荞麦的有效指标，其中吉林省Co 含量、四川省Cr 含量、内蒙古东部Rb 含量、陕西省Sr 和Ba 含量最高。经交叉验证检验和回代检验验证，荞麦产地的正确判别率分别是93.3%和98.3%，表明矿质元素指纹分析对荞麦产地溯源研究是可行的。