宏基因组二代测序技术在儿童重症肺炎病原学诊断中的应用价值研究

周焱 周欣 齐旭升

肺炎是儿童常见的呼吸道感染性疾病, 其中重症肺炎占7%～13%, 临床表现为气促、呼吸困难、持续性低氧血症等, 易诱发呼吸衰竭、肺性脑病及多器官脏器功能衰竭, 近60%不良预后患儿不能明确病原体, 延误治疗［1］。致病菌的检出对疾病的精确诊断、指导临床用药、减少住院时间、改善预后至关重要［2］。宏基因组二代测序(metagenomics next-generation sequencing, mNGS)作为新兴的检验技术, 不依赖传统的微生物培养, 不需要特异性扩增, 不需要预定假设,能一次性同时对上百万条DNA 分子进行测序, 与信息库进行对比分析, 即可明确样本中所含病原微生物的种类及数量［3］, mNGS 绕过了微生物的分离及培养过程, 具有病原体检出性率高、快速、准确等特点, 且不受抗生素及激素使用等因素的影响。目前mNGS 已逐步应用于临床疑难感染性疾病的诊断, 对呼吸道感染、神经系统感染、血行感染、关节腔感染均发挥着显著作用, 本研究旨在探讨mNGS 技术对儿童重症肺炎的临床指导意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料 回顾性分析2019 年10 月～2023 年1 月于本院儿科重症监护病房(PICU)住院治疗的71 例重症肺炎患儿的临床资料, 均行mNGS 检测, 其中男43例, 女28例；月龄9.0(3.0～21.0)个月, 治愈出院62例。患儿家属均签署知情同意, 本研究获医院伦理委员会审核通过。

1.2 纳入及排除标准

1.2.1 纳入标准 ①年龄<14 岁；②满足重症肺炎的诊断标准［4］；③样本均送检同一家公司(本研究送检单位为华大基因公司)。

1.2.2 排除标准 ①原发性免疫缺陷；②肺部肿瘤性疾病；③心力衰竭导致的肺水肿；④临床资料不完整。

1.3 研究方法

1.3.1 资料搜集 临床资料收集包括性别、年龄、PICU 住院天数、是否有先天性心脏病、是否使用抗生素、是否机械通气及治愈出院情况。实验室检测包括WBC、PLT、Hb、PCT、氧合指数、LDH。

1.3.2 检测方法 取患儿的深部痰液或支气管肺泡灌洗液作为标本, 均行mNGS 外送检查, 同时行传统病原学检测(traditional pathogen detection, TPD)。规范采集mNGS 送检标本, 样本的储存及运送标准参考专家共识［5］。送检华大基因公司, 行病原微生物DNA 高通量测序, 根据测序结果与病原学文库对比进行信息分析,得出最终报告。TPD 包括：①培养及形态学：痰液和支气管肺泡灌洗液细菌及真菌培养、支原体培养、抗酸染色；②聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)：呼吸道合胞病毒、腺病毒、甲型流感病毒、鼻病毒、乙型流感病毒、博卡病毒、副流感病毒、偏肺病毒、EB 病毒、支原体、衣原体；③血清学检测：腺病毒抗体、支原体抗体、EB 病毒抗体。

1.3.3 mNGS 报告解读标准 mNGS 报告的解读尚无统一标准, 本研究参考相关文献［6］, 满足以下至少1 条标准, 可认为是致病菌, 判定标准：①mNGS 与TPD 结果均提示为同种病原体, 并排除污染、定植因素；②mNGS 与TPD 结果不一致, 但根据患儿临床表现、影像学表现、实验室检查综合判断符合该病原特点；③针对用药后, 患儿病情缓解。

1.4 统计学方法 采用SPSS 25 软件对数据进行分析,符合正态分布的计量资料以均数±标准差(±s)表示,采用t 检验；不符合正态分布的计量资料以中位数和四分位数间距［M(P25, P75)］表示, 两组独立样本采用Mann-Whitney U 检验。计数资料以率(%)表示, 组间比较采用χ2检验。一致性判定采用Kappa 检验, 显著性比较采用配对χ2检验(McNemar test)。以P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 mNGS 与TPD 病原体检测结果比较 71 例患儿经mNGS 病原体检测阳性66 例, 阳性率为93.0%；TPD 病原体检测阳性51 例, 阳性率为71.8%；两者病原体检测结果一致性较差(Kappa=0.234), mNGS 病原体检测阳性率显著高于TPD, 差异具有统计学意义(P=0.001<0.05)。见表1。

表1 mNGS 与TPD 病原体检测结果(n)

2.2 mNGS 与TPD 细菌检测结果比较 TPD 细菌检测阳性率为38.0%(27/71), 培养时间为(79.2±15.7)h；mNGS 细菌检测阳性率为67.6%(48/71), 检出时间为(54.0±16.9)h。两者细菌检测阳性率一致性较差(Kappa=0.299), mNGS 细菌检测阳性率显著高于TPD,检出时间显著短于TPD, 差异均有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 mNGS 与TPD 细菌检测结果(n)

2.3 mNGS 细菌检测阳性的影响因素分析 71 例患儿经mNGS 细菌检测阳性48 例(67.6%)作为mNGS 阳性组, 阴性23 例(32.4%)作为mNGS 阴性组。mNGS阳性组的月龄显著小于阴性组, WBC、PLT 显著高于mNGS 阴性组, 差异均有统计学意义(P<0.05)。两组性别、Hb、LDH、PCT、抗生素使用率、氧合指数、先天性心脏病发生率、机械通气率、PICU 住院天数、治愈出院率比较差异均无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表3 mNGS 细菌检测阳性的影响因素分析［n, M(P25, P75), ±s］

表3 mNGS 细菌检测阳性的影响因素分析［n, M(P25, P75), ±s］

注：与mNGS 阴性组比较, aP<0.05；1 mm Hg=0.133 kPa

指标 mNGS 阳性组(n=48) mNGS 阴性组(n=23)性别(男/女) 29/19 14/9月龄(个月) 5.5(2.3, 18.8)a 18.0(3.0, 54.0)WBC(×109/L) 13.2(8.5, 18.6)a 9.6(5.7, 13.8)Hb(g/L) 107.6±17.4 110.5±24.3 PLT(×109/L) 466.2±258.7a 295.7±192.1 LDH(U/L) 364.2(309.6, 441.9) 413.9(338.6, 537.0)PCT(μg/L) 1.0(0.3, 3.6) 0.9(0.3, 6.7)抗生素使用 36(75.0) 15(65.2)氧合指数(mm Hg) 272.4±89.7 286.3±117.6先天性心脏病 20(41.7) 7(30.4)机械通气 44(91.7) 18(78.3)PICU 住院天数(d) 9.0(6.0, 12.0) 8.0(6.0, 13.0)治愈出院 42(87.5) 20(87.0)

2.4 TPD 细菌检测阳性的影响因素分析 71 例患儿经TPD 细菌检测阳性27 例(38.0%)作为TPD 阳性组, 阴性44 例(62.0%)作为TPD 阴性组。TPD 阳性组的抗生素使用率55.6%(15/27)显著低于TPD 阴性组的81.8%(36/44), WBC 显著高于TPD 阴性组, 差异均有统计学意义(P<0.05)。两组性别、月龄、Hb、PLT、LDH、PCT、氧合指数、先天性心脏病发生率、机械通气率、PICU 住院天数、治愈出院率并比较差异均无统计学意义(P>0.05)。见表4。

表4 TPD 细菌检测阳性的影响因素分析［n, M(P25, P75), ±s］

表4 TPD 细菌检测阳性的影响因素分析［n, M(P25, P75), ±s］

注：与TPD 阴性组比较, aP<0.05

指标 TPD 阳性组(n=27) TPD 阴性组(n=44)性别(男/女) 16/11 27/17月龄(个月) 6.0(2.0, 20.0) 9.0(3.0, 31.8)WBC(×109/L) 13.5(10.8, 22.5)a 10.0(6.1, 14.6)Hb(g/L) 105.8±17.1 110.3±21.3 PLT(×109/L) 414.0±206.5 405.4±275.0 LDH(U/L) 386.9(330.0, 447.4) 347.5(309.2, 471.6)PCT(μg/L) 1.3(0.4, 3.6) 0.7(0.3, 5.0)抗生素使用 15(55.6)a 36(81.8)氧合指数(mm Hg) 282.1±98.2 274.0±100.6先天性心脏病 9(33.3) 18(40.9)机械通气 26(96.3) 36(81.8)PICU 住院天数(d) 10.0(5.0, 12.0) 8.0(7.0, 13.0)治愈出院 22(81.5) 40(90.9)

3 讨论

肺炎是儿童死亡的主要原因之一［7］, 随着抗感染药物、免疫抑制剂、生物制剂的广泛使用, 合并免疫缺陷的患儿生存率不断增加, 机会致病菌的侵入使得感染病原体的种类也在发生相应改变。与其他传染病一样, 预后与及时充分的应用初始抗生素治疗有关。儿童免疫功能低下、气道狭短、黏膜屏障发育不完善极易患呼吸道感染, 但病原体没有明确识别时往往很难进行针对性用药, 病情短时间恶化, 会导致呼吸衰竭、严重脓毒症、多器官功能衰竭等严重后果, 甚至死亡［8］。因此, 快速、准确识别病原微生物成为儿童重症社区获得性肺炎(community acquired pneumonia,CAP)精准抗感染治疗的关键, 可显著改善住院患儿最终预后［9］。

本研究中mNGS 对于致病菌的诊断效能明显高于TPD, Kappa 检验提示两者一致性较差, 提示mNGS 可以作为TPD 的补充, 但不能相互取代。细菌检测方面, 本研究mNGS 细菌检测阳性率显著高于TPD(67.6%VS38.0%), 与李荷楠等［10］研究结果相近,感染细菌种类及耐药性有较强的地域性［11］, mNGS 未能提供准确耐药性报告, 需依据当地不同病原体耐药性水平进行临床调整用药。本院重症肺炎患儿以肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、流感嗜血杆菌为主要致病菌。值得注意的是, 对比传统培养法, mNGS 对厌氧菌的检测具有显著优势, 3 例患儿检出放线菌, 此类病菌常定植于人的口腔黏膜、鼻咽、扁桃体等部位, 肺部感染少见, 当患儿免疫力低下时可机会性感染人体各个器官部位。肺放线菌病的临床特征无典型表现, 主要表现为咳嗽、咳痰、呼吸困难等非特异性呼吸道症状, 极易误诊, 即使通过mNGS 已检出放线菌核酸序列, 但肺部影像未见“空洞-悬浮气泡征”等特征表现, 同时缺乏手术确诊依据, 以常规抗感染治疗后顺利出院, 因此均未诊断肺放线菌病, 但其中1 例患儿出院后症状复发, 多次反复住院, 最终考虑肺放线菌病,开始长期用药, 可见当临床疑似肺放线菌病时可完善厌氧环境下培养并延长培养周期, 必要时采用纤维支气管镜下行组织病理活检明确诊断, 以免漏诊。本次常规细菌检测主要为培养法, 阳性率低, 培养时间长达3～5 d, 相比本院mNGS 平均54 h 的报告时间, 明显偏长, 且检出病原体种类有限［12］, 如2 例百日咳杆菌、1 例惠普尔养障体均由mNGS 检出。但随着分子微生物学在下呼吸道细菌感染中的应用越来越广泛［13］, 常见细菌, 如肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、大肠埃希菌等, PCR 检测逐渐兴起, 对病原体的检出起着重要的作用。既往研究表明, 入院前72 h 接受抗生素治疗的患儿, PCR 检测细菌病原体阳性率显著高于培养法(78%VS32%), 且抗生素使用对PCR 检出率的影响明显小于传统培养方法。mNGS 为核酸测序, 同样受微生物活性及抗生素使用的影响较小［14-18］。本研究中, mNGS 阳性组的抗生素使用率(75.0%)与mNGS 阴性组(65.2%)比较, 差异无统计学意义(P>0.05)。但基于mNGS 无偏倚和高度敏感的特点, 检测报告中可能会出现假阳性结果, 且难以区分下呼吸道病原体或定植菌, 如本研究中就有1 例患儿检出结核分枝杆菌复合群, 检出序列数为8, 但影像学、结核菌素试验(PPD)、结核分枝杆菌核酸等检测均不满足该诊断, 因此考虑假阳性, 并予以排除。对于有菌部位的样本临床医生需多方验证, 将病原体与正常微生物和环境污染物区予以区分, 查阅参考既往文献中相应病原体的致病报告, 另可采用PCR 技术对mNGS 检出病原进行复核［19-23］, 而未能正确解读报告将会导致误诊, 延误患儿病情［24,25］。

综上所述, mNGS 是未来危重症感染患儿精准诊疗的发展方向, 可显著提升儿童重症肺炎病原体检出率, 与TPD 互为补充, 是精准治疗及避免抗生素广覆盖使用的关键, 对临床合理用药有重要指导作用, 做到早期识别, 早期干预, 进而改善患儿预后。