马铃薯丝氨酸羧肽酶类蛋白StSCPL家族的鉴定及干旱胁迫响应分析

晋 昕,魏玉溪,陈正亮,王泽民,张国栋,杨江伟,张 宁,司怀军

(1.省部共建干旱生境作物学国家重点实验室, 甘肃 兰州 730070; 2.甘肃农业大学生命科学技术学院, 甘肃 兰州 730070;3.忻州师范学院生物系, 山西 忻州 034099)

气候的异常变化导致各种生物和非生物胁迫频发,严重影响作物正常的生产种植。马铃薯(SolanumtuberosumL.)是世界上产量最高的非谷物粮食作物,同时也是浅根系作物,干旱等非生物胁迫不仅严重抑制其植株的正常生长发育,也是导致其块茎产量损失和质量下降的主因[1-2]。因此,深入挖掘抗旱分子元件,研究马铃薯耐旱的分子机理,对未来培育抗性新品种意义重大。为了应对各种非生物胁迫,植物体内形成了多水平且复杂的胁迫响应与耐受机制,主要是一系列生化和生理适应,依赖于胁迫相关基因的调控表达[3]。丝氨酸羧肽酶类(Serine carboxypeptidase like,SCPL)蛋白属于SC羧肽酶中的S10家族[4-6],其在结构和功能上与丝氨酸羧肽酶(Serine carboxypeptidase,SCP)基本相似,由催化中心和α/β水解酶三级结构组成,均含有1个细胞内分泌和转运的信号肽、4个底物结合位点、多个N-糖基化位点以及与催化作用相关的进化保守区域[6-7]。

SCPL基因家族在生物和非生物胁迫响应过程中表现活跃,在不少作物上得到证实。番茄(SolanumlycopersicumL.)中,I型SCPL基因在机械损伤和茉莉酸甲酯(MeJA)诱导下显著上调表达,因此被鉴定为“晚期创伤诱导基因”之一[8];水稻(OryzasativaL.)中,过表达OsBISCPL1的转基因水稻植株对丁香假单胞菌的抵抗力显著强于野生型水稻植株,且转基因植株中OsPR1、OsPR2、OsPR5和OsPDF1.2等防御相关的基因均呈组成型上调表达。此外,过表达OsBISCPL1的植株对氧化应激的耐受性显著增强,氧化应激相关基因表达量也显著上升[9]。高感白粉病的黄瓜(CucumissativusL.)品种D8接种白粉病菌后,7个CsaSCPLs的表达水平显著上升,1个(CsaSCPL1)呈明显下调表达;在盐胁迫处理下,黄瓜叶片中CsaSCPL2、CsaSCPL11和CsaSCPL19显著上调表达,CsaSCPL1的表达量显著下降;而黄瓜根中仅CsaSCPL11的表达量增加,CsaSCPL2、CsaSCPL16和CsaSCPL18均显著下调表达[4]。小麦(TriticumaestivumL.)中,TaSCPL184-6D在干旱、盐和ABA处理下均显著上调表达,且其过表达系干旱处理后的存活率和脯氨酸(Pro)含量均显著高于野生型,而丙二醛(MDA)含量显著低于野生型;对TaSCPL184-6D过表达系进行盐处理(150 mM NaCl)后发现,所有转基因株系的根长和鲜质量均显著优于野生型[10]。在干旱、盐碱、光照、缺氮、缺磷、极端温度等多种非生物胁迫下,植物中花青素也常被诱导产生[11-14],同时原花青素也参与多种非生物胁迫响应[13]。研究显示,在拟南芥中SCPL基因AT2G23000编码一个花青素酰基转移酶,该酶是合成酰化花青素的关键酶[15]。而SCPL18和SCPL18异构体X3均参与了铁皮石斛花青素的生物合成[16],可能在非生物胁迫中发挥作用。

SCPL基因在植物非生物胁迫响应中的重要作用已有报道,但其在马铃薯中的具体功能研究尚不多见。基于此,本研究通过全面描述马铃薯全基因组中SCPL基因家族的数量、结构、染色体位置和系统发育等,研究StSCPLs基因在激素处理、不同胁迫条件下的表达差异,同时通过高通量测序对干旱耐受型和干旱敏感型马铃薯品种中StSCPLs的表达差异进行分析。此外,初步构建了lncRNA与StSCPLs互作调控网络,以期为进一步分析马铃薯StSCPLs在干旱胁迫响应中的功能奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料及试验处理

供试马铃薯品种为‘陇薯10号’(L,干旱耐受型)和‘大西洋’(D,干旱敏感型)[17]。筛选大小一致的马铃薯种薯(重量约150 g)种植在花盆中,置于温室培养,温度(25±2)℃,自然光照射。待其发芽后,每周用完全营养液给植株浇水和施肥1次。植株生长至25 d时,选择生长状态整齐一致的植株进行干旱处理(每天16∶00对照组正常浇水,干旱处理组浇15%的PEG-6000水溶液),处理5 d后收集马铃薯植株顶部的第3～5片叶用于转录组测序(RNA-seq),试验设3个重复,每个重复10株。

选取生长状态一致的‘大西洋’盆栽植株,进行干旱胁迫处理。其中对照组(CK)土壤含水量保持在75%～80%,干旱胁迫组为WS1、WS2和WS3共3组,其土壤含水量分别保持在55%～60%、35%～40%和15%～20%。每天2次(10∶00和16∶00)使用TDR-300传感器(Spectrum R, Aurora, Illinois, USA)监测土壤含水量。处理完成后收集马铃薯植株顶部的第3～5片叶,置于液氮中速冻,保存于-80℃,后续用于实时荧光定量PCR(RT-qPCR)试验,每个处理均包含3次生物学重复。

1.2 试验设计

1.2.1 基因家族鉴定及进化分析 马铃薯基因组相关数据从马铃薯数据库PGSC(http://spuddb.uga.edu/)下载,并构建本地数据库。在NCBI中下载已注册的拟南芥SCPL转录因子序列,结合Pfam蛋白家族数据库(http://xfam.rog/)中的隐马尔科夫模型(HMM,e-value<0.01;PF00450),利用BLAST(e-value<1×10-5)比对鉴定,在全基因组水平鉴定筛选马铃薯SCPL家族初步比对的候选成员。在NCBI-CDD(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb)进行结构域比对分析,最终确定马铃薯SCPL家族成员。

1.2.2 基因结构和氨基酸保守结构分析 参照Wang等[18]方法分析马铃薯StSCPLs基因结构。利用MEGA 7.0软件中的Align by muscle程序对马铃薯与拟南芥SCPL家族成员的蛋白序列进行多序列比对,并采用邻接法(Neighbor-joining,NJ)构建系统进化树,Bootstrap参数设置为1 000。

1.2.3 家族成员在染色体上的位置分析 参照Wang等[18]方法,同时运用TBtools(v1.0986)软件绘制马铃薯SCPL基因在染色体上的分布图,并对其进行共线性分析。

1.2.4 家族成员启动子区顺式作用元件分析 从马铃薯基因组数据库(http://solanaceae.plantbiology.msu. edu/pgsc)中获取马铃薯StSCPLs基因启动子区序列信息。利用PlantCARE数据库(http://bioinformatics.psb.ugent.be/ webtools/plantcare)搜索转录起始位点(ATG)上游1.0 kb区域,以分析顺式作用调控元件。

1.2.5 马铃薯SCPL家族表达分析 利用数据库PGSC(http://spuddb.uga.edu/)中马铃薯基因在不同组织及生长时期的转录组测序(RNA-Seq)数据,对马铃薯StSCPLs在不同组织及生长时期进行表达分析。利用数据库PGSC(http://spuddb.uga.edu/)中马铃薯基因在不同胁迫条件下的RNA-Seq数据,分析StSCPLs在非生物胁迫、生物胁迫及激素处理下的表达模式。

利用转录组测序分析干旱胁迫下马铃薯StSCPLs在2个不同抗旱性品种中的表达差异。测序及数据处理如下:以马铃薯mRNA为模板,用6碱基随机引物和逆转录酶合成cDNA第一链,并以其为模板进行第二链cDNA的合成。完成文库构建后,采用PCR扩增进行文库片段富集,使文库大小为450 bp。然后,通过Agilent 2100 bioanalyzer对文库进行质检。根据文库有效浓度以及文库所需数据量,将含有不同Index序列的文库按比例进行混合。混合文库统一稀释到2 nM,通过碱变性获得单链文库。样品经过RNA抽提、纯化、建库之后,采用第二代测序技术(Next-generation sequencing,NGS),基于Illumina HiSeq测序平台,对文库进行双末端(Paired-end,PE)测序(南京派森诺基因科技有限公司)。样品经过上机测序,生成FASTQ的原始数据(Raw data)。对每个样品的下机数据(Raw data)分别进行统计,包括样品名、模糊碱基所占百分比、以及Q20(碱基识别准确率在99%以上的碱基所占百分比)和Q30(碱基识别准确率在99.9%以上的碱基所占百分比)。数据过滤:(1)采用Cutadapt去除3′端带接头的序列;(2)去除平均质量分数低于Q20的Reads。使用TopHat2的升级版HISAT2软件(http://ccb.jhu.edu/software/hisat2/index.shtml)将过滤后的Reads比对到马铃薯参考基因组(DM_1-3_516_R44_potato_genome_assembly.v6.1.fa),计算相关基因表达量。

为进一步分析干旱胁迫下马铃薯StSCPLs表达模式,采用SYBR Green Premix Pro Taq HS qPCR KIT(艾科瑞,中国长沙),使用Light Cycler 96荧光定量PCR仪(罗氏,瑞士)进行qRT-PCR。反应总体积20 μL,其中10 μL 2×SYBRGreen Pro Taq HS Premix,0.8 μL引物(正向和反向引物各0.4 μL),1 μL cDNA(100 ng)模板及8.2 μL ddH2O。反应程序如下:95℃,30 s,随后95℃,5 s和60℃,30 s,共40个循环,内参基因为StEF1α(GenBank ID: AB061263.1)。试验设3个生物学重复和3个技术重复,并用2-ΔΔCt法计算基因的相对表达量,内参基因为StEFla[18]。

2 结果与分析

2.1 马铃薯StSCPL家族的鉴定及进化分析

通过HMM(e-value<0.01)扫描、BLAST(e-value<1×10-5)比对和CDD搜索相结合的方法,在马铃薯中共鉴定出41个StSCPL成员。所有StSCPLs的登录号均可在GenBank中获得(表1)。马铃薯StSCPLs的41个基因存在长度差异,从1 053 bp(StSCPL9)到2 760 bp(StSCPL13)不等,编码蛋白长度为350～919 aa(表1)。为进一步研究马铃薯SCPL的进化关系,利用拟南芥(54个)和马铃薯(41个)SCPL家族成员构建了系统进化树(图1,见14页)。结果显示,41个StSCPL分别属于Group I～III 3个亚族。其中,I组成员最多(17个),II组为13个成员,III组最少(11个),与其他物种中SCPL的研究结果相似[10, 19-21]。

2.2 马铃薯StSCPLs基因结构、染色体及古多倍化

外显子-内含子结构在基因家族的进化中起着至关重要的作用[4]。利用GSDS(Gene structure display server 2.0)分析获得41个StSCPL基因的外显子-内含子结构。结果显示,外显子数目最少和最多的StSCPL基因均在Group I中,StSCPL24和StSCPL36均只含有1个外显子,StSCPL29的外显子数目最多(27个),其余StSCPL基因均包含多个外显子(图2A)。不含UTR区的马铃薯SCPL基因共发现9个,分别是StSCPL5～7、StSCPL10～13、StSCPL23、StSCPL29;除StSCPL29属于Group I,其余均属于Group III。41个StSCPL基因分布在除8号染色体外的11条染色体上(图3,表1),集中分布在1～6号染色体上,其中1号和6号染色体上的StSCPL基因较多,分别为13个和8个。在3号、5号、9号和12号染色体上各分布有1个StSCPL基因。StSCPLs基因的古多倍化分析结果显示,2个StSCPL基因(StSCPL40和StSCPL28)参与了1个片段重复事件。除片段重复外,还发现2次串联重复事件,包含4个StSCPL成员(StSCPL39和StSCPL40;StSCPL17和StSCPL27),其中StSCPL40同时参与了片段复制和串联复制(图3)。

注:利用MEGA7中41个StSCPLs和54个AtSCPLs蛋白的保守氨基酸序列,通过ClustalW生成无根树。亚族组由不同的颜色区分。

注:马铃薯1～12号染色体以圆形形式显示;红色曲线表示马铃薯StSCPL基因之间的复制关系。

2.3 马铃薯StSCPLs的蛋白质结构和保守基序

通过MEME(Multiple expectation-maximization for motif elicitation)分析确定了StSCPL蛋白包含的5个保守基序(图2B)。结果显示,不同StSCPL蛋白包含的基序数介于3～5个,长度为15～50个氨基酸。其中马铃薯StSCPL9和StSCPL21仅含有motif 1～3,而StSCPL4、StSCPL12、StSCPL23和StSCPL32各含有4个motif,其余绝大多数StSCPLs包含全部5个保守基序。StSCPL13含有的motif数目最多,包含了两组motif 1～5共10个基序(图2B)。以上结果表明,不同的StSCPL可能在植物生长发育和胁迫反应中的作用具有差异。

2.4 马铃薯StSCPLs启动子区顺式作用元件分析

为了进一步了解StSCPL基因潜在的调控机制,尤其是与胁迫响应和激素相关的调控机制,使用PlantCARE检测了每个基因转录起始位点上游1.0 kb序列中的顺式作用元件。如图4所示(见16页),多种激素响应相关的顺式作用元件在马铃薯StSCPLs的启动子区被发现,如ABA、MeJA、GA、SA和生长素响应元件;除基本基因表达控制元件(CAAT和TATA)外,与胁迫响应和激素相关的顺式作用元件根据功能可分为9组。多数StSCPLs的启动子区均发现了参与ABA和MeJA响应性的顺式作用元件,ABA和MeJA已被证明广泛参与植物对各类胁迫的防御,这表明多数StSCPL基因可能参与马铃薯胁迫响应。干旱响应元件,如脱水响应元件(DRE)和参与干旱诱导(MBS)元件的MYB结合位点,也被发现存在于多个StSCPLs启动子中。其他非生物胁迫响应元件(如MYC)也在StSCPLs基因启动子中发现。综上可知,马铃薯StSCPLs可能广泛参与非生物胁迫响应。

2.5 马铃薯StSCPLs响应胁迫表达分析

2.5.1 马铃薯StSCPLs在非生物/生物胁迫及激素处理下的表达分析 马铃薯StSCPLs基因在响应非生物胁迫中的功能目前尚不明确。为进一步了解StSCPL基因的潜在功能,利用转录组数据(DM 1-3 516 R44─Gene Expression Matrix (TPM)-v6.1)分析了其在非生物胁迫下(盐胁迫,150 mmol·L-1NaCl;高温,35℃;甘露醇,260 μmmol·L-1处理24 h)的表达量。结果表明,大多数StSCPL基因能够响应非生物胁迫,其中响应热胁迫的成员较多(图5)。盐胁迫和热胁迫下,分别有20个(StSCPL2/4/9/10/14/17/18/19/22/23/25/16/21/28/29/30/31/32/35/38)和8个(StSCPL1/2/5/6/15/25/37/38)基因上调表达。值得注意的是,StSCPL7和StSCPL29在盐胁迫和高温胁迫中呈现完全相反的表达模式,在盐胁迫中上调表达,而在热胁迫下表达降低(图5)。在模拟干旱(甘露醇,Mannitol)处理下,StSCPL4/14/24/32/37等17个StSCPLs上调表达。StSCPLs基因家族成员在不同激素处理(50 μM ABA、50 μM GA3、10 μM IAA和10 μM BAP, 24 h)下的表达模式存在较大差异,多数家族成员对IAA和GA3处理响应较明显,分别有27个和29个StSCPLs上调表达,还有17个成员在ABA处理下上调表达。同时,部分StSCPL基因同时响应激素和非生物胁迫,例如StSCPL14(盐、干旱、ABA、IAA和GA3)、StSCPL35(盐、干旱、ABA和IAA)等。在生物胁迫下,马铃薯晚疫病菌(Phytophthorainfestans)侵染叶片时,StSCPL11和StSCPL12的表达量均上调,其余成员表达量下调或者不变。此外,大部分StSCPLs在BABA(β-氨基丁酸,β-aminobutyric acid)处理后表达量升高。综上所述,StSCPLs基因能够响应不同的逆境胁迫和激素处理,这与启动子顺式作用元件分析结果相一致。

2.5.2 不同抗旱性马铃薯品种中StSCPLs在干旱胁迫下的表达分析 为深入了解StSCPL家族基因在干旱胁迫响应中的潜在作用,通过转录组测序分析耐受性不同的栽培品种L和D在干旱胁迫下StSCPLs的表达。结果表明,干旱胁迫导致StSCPLs表达谱发生显著变化(图6,见18页),这与模拟干旱条件下的基因表达量变化结果相似(图5)。而且,2个抗旱性不同的马铃薯品种中StSCPLs基因的表达存在明显差异,如StSCPL3和StSCPL34在干旱敏感型品种中分别下调表达7倍和8倍,但其在干旱耐受型品种中的表达量无显著变化。

2.5.3 干旱胁迫下马铃薯StSCPLs表达模式分析 为深入分析马铃薯StSCPL基因在干旱胁迫响应中的作用,根据RNA-Seq数据,筛选出了干旱胁迫下表达量变化超过2倍的18个马铃薯StSCPL基因家族成员(StSCPL2,StSCPL3,StSCPL6,StSCPL8,StSCPL14,StSCPL16,StSCPL17,StSCPL19,StSCPL22,StSCPL24,StSCPL26,StSCPL27,StSCPL28,StSCPL31,StSCPL32,StSCPL34,StSCPL35,StSCPL38),利用qRT-PCR进一步分析了上述基因在干旱胁迫下的表达模式。结果显示(图7,见17页),12个基因的表达模式呈现先上升后下降的趋势,除StSCPL8外,这些基因的最高表达量均出现在土壤水分含量为55%～60%(WS1)时,随着干旱程度的加重,其表达量不同程度下降,当土壤水分含量为15%～20%(WS3)时,大部分基因的表达量回落到与CK相同的水平,甚至显著低于CK中的表达量。不同于其他基因,StSCPL3的表达量呈现先上升后快速下降,然后再次上升的变化趋势。值得注意的是,StSCPL32的表达量随干旱胁迫程度增加呈现上升的趋势,其在WS3中的表达量显著高于对照(图7A)。另外4个StSCPLs的表达模式与上述基因完全相反,随干旱胁迫程度的加剧表现为先下降后上升的趋势,仅StSCPL22在WS3中的表达量显著高于CK,其余基因与CK差异不显著(图7B)。

2.6 LncRNA及其靶StSCPL介导的调控网络

长链非编码RNA(lncRNA)作为蛋白质编码基因的顺式或反式调控因子,在植物响应非生物胁迫中发挥重要作用[22-24]。最近,转录因子StCDF1被鉴定为马铃薯lncRNAStFLORE的靶基因,StCDF1-StFLORE位点对营养繁殖和保持水分稳态很重要[25-26]。为深入探究StSCPLs在马铃薯响应胁迫中的作用,进一步构建了lncRNAs及其靶基因StSCPLs介导的调控网络(图8,见18页)。在马铃薯中预测并鉴定了26个StSCPLs及其对应的23个lncRNAs,其中,StSCPL18受3个lncRNA顺式调控,其次是StSCPL24、StSCPL27和StSCPL36,各受2个lncRNA调控。值得注意的是,StSCPL3/4/5/6/7受同一个lncRNAMSTRG.2301.1调控,而StSCPL9/10/11/12/13为同一个lncRNAMSTRG.4102.2的靶基因。结果表明,在马铃薯生长发育和胁迫响应中StSCPL可能通过多个维度发挥其调控作用。

注:所有确定的顺式作用元件被分为9组(用不同的颜色表示)。

注:2个品种StSCPL差异表达基因的RNA-Seq数据。D0、L0为对照,D1、L1为干旱处理后5 d。

3 讨 论

植物SCPL蛋白属于蛋白质水解酶家族,目前多个物种中均已鉴定、分离到SCPL基因及其蛋白。研究显示SCPL在植物生长发育(种子萌发、细胞程序性死亡、次生代谢产物的合成)及生物和非生物胁迫应答中发挥了重要作用。但是马铃薯SCPL基因家族的研究目前鲜见报道。本研究从马铃薯全基因组中鉴定出41个StSCPLs成员并进行了系统分析。SCPL基因家族成员数目在不同物种间差异较大,如拟南芥[21]、茶树[20]、黄瓜[4]及葡萄[27]中分别为54、47、27个和59个,黄瓜中CsaSCPL基因数目明显偏少[4],而小麦[10]中目前鉴定到的SCPL基因数目高达210个。研究显示,上述物种中SCPL基因的数量与其自身基因组的大小并无关系,可能主要与基因复制事件有关[4],马铃薯中仅有5个成员参与了基因复制事件。马铃薯41个StSCPLs基因在其11条染色体上均有分布,且呈不均等分布(表1,图3)。SCPL蛋白分布于3个不同的亚家族,在各亚家族的分布数量表现为Group II> Group I> Group III,本研究中马铃薯SCPLs的分布与拟南芥、茶树等物种具有相似性[10, 20-21]。

研究表明,许多物种中SCPL基因表现出对ABA和多种非生物胁迫(脱水、盐、渗透和冷胁迫)的响应诱导[10]。研究人员对小麦TaSCPL基因的启动子序列的顺式作用元件分析表明,TaSCPL基因的启动子序列富集了干旱、ABA和MeJA响应元件[10]。本研究鉴定到大多数马铃薯StSCPLs基因的启动子区域至少存在一种激素响应元件,且ABA响应元件和DRE干旱响应元件等胁迫响应元件广泛存在于StSCPLs启动子区域中。此外,激素和干旱胁迫处理显示,大部分StSCPLs对ABA响应明显,且在不同抗旱性的马铃薯品种中差异表达。这与拟南芥AtSCPL启动子中广泛存在对植物激素和非生物胁迫响应的顺式元件(如ABRE和DRE)的结果相一致[28]。有研究显示,拟南芥AtSCPL30基因的启动子PD1～PD9在烟草转基因植株的几乎所有组织和发育阶段都能实现转入基因的强组成型表达;在正常和胁迫条件下,启动子PD2～PD7驱动转基因表达始终高于CaMV35S启动子,差异在2倍以上[29],表明其在拟南芥生长发育过程中发挥重要作用,可以在马铃薯中发掘类似的启动子元件。

LncRNA主要参与基因转录和表达的表观遗传和转录调控[22],其已被证实与各种植物的胁迫响应有关[30-33]。研究显示,lncRNA生长素调控的启动子环(AtAPOLO)与转录因子WRKY42相互作用,在拟南芥应对寒冷时触发根毛细胞生长,从而减轻低温的影响[32]。在对棉花盐胁迫的响应中,lncRNA973通过调控活性氧清除基因、转录因子和盐胁迫相关基因的表达[32],使棉花能够在盐胁迫下生长。LncRNATCONS_00021861通过竞争性内源性RNA调控与水稻的耐旱性相关[23]。最新研究表明,马铃薯lncRNAStFLORE通过负调控其靶基因StCDF1影响气孔生长和日开放来调控水分损失,进而调节干旱胁迫下马铃薯块茎发育[25]。而本研究预测了26个StSCPLs受不同lncRNA调控,其中8个StSCPLs由多个lncRNA调控;初步构建了lncRNA和靶StSCPL相互作用网络,有助于全面了解马铃薯StSCPLs在干旱胁迫响应中的功能。

4 结 论

在全基因组水平从马铃薯基因组中鉴定了41个StSCPLs基因,并根据系统发育将其分为3个亚族。通过同源性分析鉴定出2个基因重复事件和1对同源基因。StSCPLs基因启动子含有潜在的激素和胁迫响应相关元件,表明StSCPL基因可能参与多种激素和胁迫响应途径。干旱胁迫下,StSCPL基因在抗旱能力不同的2个品种中差异表达;18个StSCPLs基因表达量发生显著变化,其中14个呈现先上升后下降的表达模式,说明StSCPLs广泛参与马铃薯干旱胁迫响应。LncRNA及其靶StSCPL介导的调控网络显示,StSCPL3和StSCPL34分别是lncRNAMSTRG.2301.1和lncRNAMSTRG.19548.1的靶基因,在不同干旱耐受性品种中显著差异表达,可能是马铃薯对干旱胁迫响应的潜在靶点。本研究为深入研究马铃薯StSCPLs的功能提供了理论基础。