非酒精性脂肪性肝病与肠道微生态

邱丽瑛,王迎春

随着肥胖和代谢综合征(MS)的流行,非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)的发病率逐渐上升,已成为我国最常见的慢性肝病[1]。NAFLD发病机制是基于“二次打击”假说而提出的“多重打击”假说[2]。近些年,有新的观点认为肠道菌群(intestinal microecology,IM)与NAFLD密切相关。在动物模型研究发现,肠道微生态失衡可以导致肝脏脂肪变性、炎症、甚至肝纤维化等。根据肠-肝轴理论,肠道微生态平衡被破坏时,有害的肠道细菌及其代谢产物能够通过门脉系统进入肝脏,造成机体免疫应答和炎症反应,进而导致NAFLD的发生和发展[3]。

1 肠道微生态影响NAFLD发生的机制

肠道微生物群是人体重要的“器官”,受到多种因素的影响,包括遗传、生活方式、分娩方式、饮食、活动等。肠道微生物群不仅包括肠道细菌,还包括病毒、真菌、少量古细菌和原虫,其中以细菌占大多数。相比IM,肠道病毒在人体多个系统中的作用方式还未形成明确的共识。目前,真菌中已有布拉酵母菌被用于一些疾病的临床治疗[4,5],但研究仍较少,处于探索阶段,因此我们下面重点介绍IM。目前,检测IM的技术包括16Sr核糖体RNA基因测序、DNA全基因组测序、蛋白质组学、基因组学、代谢组学和液相色谱法等[6]。人类胃肠道中共包括4644种细菌,编码1.71亿个基因。我们发现健康成年人IM主要包括厚壁菌门、拟杆菌门、放线菌门和变形菌门。大多数NAFLD/非酒精性脂肪性肝炎(NASH)患者粪便厚壁菌门数量增加,而拟杆菌门数量减少[7]。当肠道微生态结构和功能异常时,可能会影响肝脏代谢,进而促进相关疾病的发生。简单地说,菌群失调的定义是指正常的IM构成比或数量因多种原因受到破坏。根据肠道和肝脏起源于同一胚层,两者解剖位置和功能密切相关,因而提出了肠-肝轴理论。它是“双向性”结构,不仅有害的肠道细菌及产物可以通过门脉系统进入肝脏导致NAFLD,而且肝胆系统不能代谢的物质及细胞炎症因子也会进入肠腔,加重IM的紊乱[8]。

1.1 肠道屏障功能对NAFLD的影响 在正常情况下,肠道上皮是一道天然屏障,能防止有害的肠道细菌及其代谢产物转移到血液,为宿主抵御外来有害物质提供主要屏障[9]。但当肠道微生态受到各种因素的攻击,屏障被破坏,会导致内毒素通过门静脉系统进入人体血液循环。随着内毒素持续增高,通过打击肝脏进而导致NAFLD病程的不断进展,而当NAFLD发展到一定阶段后,又会加重肠道微生态失衡,两者相互影响,形成恶性循环。上皮紧密连接蛋白对维持上皮屏障完整性至关重要,其功能可受微生物调节,其高水平可防止过量的脂多糖进入肠壁血液,进而阻止肠道黏膜受损和肝脏损伤。短链脂肪酸(short-chain fatty acids,SCFAs)中丁酸通过上调紧密连接蛋白的表达起到增强肠道屏障的作用。NAFLD的发生与肠道黏膜通透性增加和肠道紧密连接蛋白的表达减少密切相关[10]。物理屏障还包括上皮细胞、免疫细胞和基质细胞,并且不同部位细胞组成亦不同。黏液层、分泌型免疫球蛋白A(secretory immunoglobulin A,SIgA)、活性氧、活性氮和各种广谱抗菌蛋白组成化学屏障,帮助机体抑制病原体和共生体共同发挥作用。粘蛋白是一种高度糖基化的聚合蛋白,有助于将微生物和有害物质从底层的上皮细胞中隔离出来。粘液素降解菌产生的代谢物包括SCFAs和硫酸盐,有助于维持肠道黏膜和促进屏障功能。屎肠球菌是一种常见的细菌共生体,能够分泌一种肽聚糖水解酶,能增强肠上皮屏障功能和病原体耐受性,还能激活宿主核苷酸结合低聚结构域蛋白2(NLRP2)信号通路,调节屏障成分的表达,如黏蛋白2、隐窝素2和c型凝集素Reg3 γ。肠道免疫屏障由上皮内淋巴细胞组成,包括T淋巴细胞(CD4+Th17,CD4+T调节细胞)、自然杀伤性T细胞、树突状细胞和单核吞噬细胞。自然杀伤性T细胞是识别和区分外来和自身抗原的重要组成部分,当其被抗原呈递细胞激活后引发免疫反应。它们也可以被促炎性细胞因子激活[11]。肠道黏膜表面共生物诱导的SIgA与微生物和微生物产物结合,可以抵御病原体、维持黏膜平衡和加强屏障功能,从而防止细菌移位。肠腔中的细菌产物如脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)、多肽、细菌及其产物等通过肠道黏膜层经门静脉进入肝脏,引起Kupffer细胞大量激活,释放一系列炎症因子,加重肠道黏膜和肝脏的损伤[10]。

1.2 肠道微生物代谢产物对NAFLD的影响 胆汁酸作为肠道重要的组成成分,在乳化膳食脂肪、调节脂质代谢和葡萄糖稳态中起到正向作用,能够抑制肠道细菌的过度生长,并且IM中的拟杆菌门和厚壁菌门能够作用于胆汁酸代谢。胆汁酸代谢是指初级胆汁酸经脱羟基等一系列反应,最终生成次级胆汁酸的过程[12],这个代谢过程需要的多种限速酶由肠道细菌合成。一般来说,肠道通透性的提高和细菌移位有可能使微生物的代谢产物通过门脉系统到达肝脏,从而导致胆汁酸代谢障碍。胆汁酸具有生物清洁剂的作用,可以溶解胆汁中的胆固醇和脂类。研究表明,胆汁酸又可作为激素样信号分子激活法尼醇X受体(farnesoid X receptor, FXR)和G蛋白偶联受体5(TGR5),诱导成纤维细胞生长因子19转录,进而抑制胆固醇7ɑ-单氧酶抑制胆汁酸的合成。胆汁酸增多会通过激活TGR5,影响肝脏糖脂代谢,进而导致炎症和纤维化。由于胆汁酸是由胃肠道中的微生物代谢的,因此细菌的变化可以影响胆汁酸的代谢转化,从而引起肝脏的炎症和胰岛素抵抗(IR)。

肠道内膳食纤维能够促进肠道蠕动而无法被降解吸收。当肠道微生态紊乱时,膳食纤维在发挥促进肠道蠕动功能的同时,又被纤维素分解性细菌产生的纤维素酶和其他酶部分降解为一系列单糖及其磷酸化产物,通过增加肠道热量的摄入,为机体供能并促进肝内脂质合成,导致肝内脂肪堆积,促进细胞代谢和生长,调节肠道pH值等。研究表明,SCFAs主要通过激活GPR41/43或通过抑制组蛋白去乙酰化酶1(histone deacetylase 1,HDAC1)发挥其生物学功能。相关动物实验表明,GPR41/43参与了脂质代谢和免疫功能调节,而其过表达可以引起IR和血脂异常[13]。研究表明,SCFAs在NAFLD中起到增强肠道屏障功能、增强脂质氧化等有益的作用。肠道SCFAs中大部分为乙酸、丙酸和丁酸,其中丁酸是最强的HDAC1抑制剂,具有调节肝脏脂代谢的作用。一项动物研究观察到,应用丁酸喂养小鼠后,能够影响小鼠肠道代谢,得出结论认为增加产丁酸盐的菌群将有助于减轻肝脏脂肪变性和肝脏炎症反应[14]。

当肠道微生态紊乱时,某些特殊菌落占优势,会大量增加产乙醇菌,如HiAlc-Kpn和溶细胞素阳性粪肠球菌,还会产生大量的内源性乙醇,而肠道微生态被破坏后,损坏的肠黏膜屏障会使更多的乙醇进入血液循环。过量的内源性乙醇最终会超出肝脏的代谢能力,除直接损伤肠黏膜屏障外,还能增加肝脏活性氧自由基生成,导致肝脏氧化应激水平升高,促进肝脏脂肪变[15]。乙醇的代谢副产品乙醛也可通过减弱肠道屏障导致细菌移位和内毒素血症。一旦肠道屏障被破坏,有害物质和毒素便会源源不断地进入血液循环,从而引起炎症反应,释放各种炎性介质和细胞因子等。同时,门静脉LPS水平不断升高,激活Toll样受体4(Toll-like receptor, TLR4),引发进一步的炎症反应。

胆碱是细胞膜磷脂的重要组成成分,能够避免肝脏脂质沉积,在从肝脏转运出脂质时发挥重要作用。研究证实,当饮食中缺乏胆碱时,肝内无法合成磷脂酰胆碱(phosphatidylcholine,PC),而PC缺乏既会影响极低密度脂蛋白的分泌和组装,也会促进脂肪酸合成,增加体内甘油三酯合成,最终导致肝脏脂肪堆积[16]。当IM平衡被打破,胆碱代谢菌数量增加,产生微生物复合酶,催化胆碱转化为多种胺类物质。一方面,导致体内胆碱数量和保护性因素减少,最终引起肝脏脂肪变性;另一方面,胺类物质可在肝脏中被代谢为三甲胺-N-氧化物(TMAO)。甲胺本身具有毒性,长期作用会使人体受到伤害。同时,甲胺在被肝脏摄取代谢过程中可影响糖脂代谢,从而诱发肝脏炎症反应[17]。

1.3 肠道微生态与炎性反应和IR 研究表明,当肠道微生态紊乱时,IM中拟杆菌门和厚壁菌门比例降低,产生内毒素的细菌增加,最终引起的肠源性内毒素血症能够诱导IR的发生。IR不仅会损害糖原合成,扰乱血糖水平,还能通过氧化应激反应和脂质过氧化机制等共同参与NAFLD的形成和发展。LPS是从肠道革兰氏阴性细菌中释放出来的毒素,能够刺激炎症反应,引起肝损伤。内毒素血症对抗原CD14系统上的LPS-TLR4单核细胞分化起作用,能激活JNK和NF-κB途径,作用于肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSC)和Kupffer细胞,进一步破坏肠道通透性和降低肝脏的胰岛素敏感性。肝脏是第一过滤器,能够滤过胃肠道微生物群代谢产物,如内毒素、LPS、鞭毛蛋白、脂磷壁酸、肽聚糖和细菌DNA等,激活TLR4和Nod样受体(NLR)。TLR4的活化导致促炎、抗病毒和抗菌细胞因子的产生。许多研究表明,LPS/TLR4信号通路介导炎症、氧化应激、IR和肝纤维化,是NAFLD组织病理学发生的关键[18]。目前,发现TLRs激活后可启动核因子κB(nuclear factor-kappa B, NF-κB)途径,诱导IL-1、IL-6、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α, TNF-α) 、α-干扰素等表达,导致脂肪组织巨噬细胞浸润,TNF-α产量增加,胰岛素敏感性逐渐降低。同时,启动适应性免疫应答信号,激活促炎因子,进一步加重患者肠道黏膜屏障的破坏,并使得患者的肠源性内毒素血症不断加重,诱导肝细胞损伤、HSC激活、IR和微循环紊乱,加重IM失调,形成恶性循环,从而加重NAFLD患者的病情[19]。

2 基于调节IM的治疗NAFLD方法

动物实验研究证实,饮食和运动疗法可使肠道微生物系统的组成发生变化,导致有益菌丰度上升,有害菌丰度下降,从而改善胰岛素敏感性以及脂肪酸和葡萄糖的降解,减少肝脏脂肪含量,进而减缓NAFLD的病情进展[20,21]。近些年,从调节肠道微生态的角度来治疗NAFLD也受到极大关注,已有一些研究证实使用微生态制剂和粪菌移植等方法治疗NAFLD是有效的[22]。

2.1 微生态制剂 微生态制剂治疗已成为一种新颖、安全和有效的方法。多项动物实验研究表明,在脂肪肝小鼠,益生菌、益生元、合生元和肠道功能性代谢产物等都具有显著的治疗效果[23]。益生菌被世界卫生组织定义为一种“当剂量足够时,对宿主健康是有益的活微生物”。目前,乳酸杆菌和双歧杆菌菌株是功能食品和膳食补充剂中使用最广泛的益生菌,但下一代益生菌,如普拉梭菌、嗜黏蛋白阿克曼菌或梭状芽孢杆菌菌株也显示出有明确的应用前景。VSL#3和改良的VSL#3是乳酸菌属、双歧杆菌属和链球菌的益生菌的混合物,已被证实对NAFLD具有保护作用,后者能通过下调TGF-β信号改善肝纤维化,抑制炎症途径丝氨酸苏氨酸激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)和NF-κB的作用[24]。在NASH动物模型,植物乳杆菌NA136通过刺激AMPK途径磷酸化ACC、抑制SREBP-1/FAS信号和刺激核因子E2相关因子2(AMPK/NF-E2-related factor 2,Nrf2)信号通路,从而达到减少脂肪生成、增强脂肪酸氧化,降低肝脏氧化应激作用。植物乳杆菌NA136已被证明可以减少高脂喂养和果糖喂养的NAFLD大鼠肝脏脂肪组织,并降低肝酶水平。副干酪乳杆菌、普拉梭菌、嗜黏蛋白阿克曼菌等可以起到减轻脂肪组织炎症,改善代谢参数等作用。一些益生菌组合制剂已显示出免疫调节潜力,包括增强抗炎细胞因子(IL-10)的产生,减少促炎趋化因子(IL-6、IL-8、CXCL 10和单核细胞趋化蛋白1)的产生。然而,益生菌组合的数据很难解释,因为不同益生菌的使用剂量和比例不同,同时还有其他影响因素需要考虑,如治疗的持续时间以及停药后数据收集时间等[20]。

益生元是食物中诱导微生物生长的化合物,在微生物群的代谢作用下,起到促进有益细菌生长的作用。多数资料表明益生元主要包括菊粉型果聚糖和低聚半乳糖,可能对NAFLD和NASH都有益处。益生元能够更好地控制普氏粪杆菌和双歧杆菌的生长,降低血清LPS水平,这是由于胰高血糖素样肽(GLP)-1的增加和GLP-2介导的肠道屏障完整性的营养效应而发挥作用。在肥胖患者,补充低聚果糖可通过调节胃饥饿素和肽YY等食欲激素诱导体质量减轻,减少患者肝脏炎症并改善代谢参数[25]。益生元治疗已被证明是一种能够恢复正常IM的有效疗法,但它可能需要与其他干预措施结合使用,以改善病情。合生元是益生元和益生菌的组合,可用于取代功能失调的IM。一项关于NAFLD患者补充益生菌、益生元和合生元治疗的meta分析提示其能引起体质指数显著下降和肝酶的改善[25]。后生素是指由细菌死亡溶解或活菌代谢分泌释放的可溶性因子,包括SCFAs、各种细菌素、维生素类、多肽、胞外多糖等,具有免疫调节及肠道屏障保护等作用。关于后生素治疗NAFLD患者的疗效研究还很少,主要限于科研研究。在老年小鼠,应用热灭活副干酪乳杆菌D3-5中的脂磷壁酸可使肠道内阿克曼氏菌丰度增加,粘蛋白显著表达,增强黏膜屏障功能,能预防高脂饮食喂养引起的代谢功能障碍[11,26]。

2.2 粪便微生物群移植(faecal microbiota transplantation,FMT) FMT是指将健康供体的肠道微生物菌群移植到患者肠道内,全面地调节患者IM,是重建IM的核心技术,涉及将健康个体粪便中的功能性微生物群转移到NAFLD患者的胃肠道中[27]。一项临床试验评估口服微生物组(SER-109)治疗复发性艰难梭菌感染的疗效,与安慰剂组相比,给予SER-109组显示出预防复发感染的卓越能力[28]。应用确定的微生物群落或微生物代谢物进行合理的治疗是可以起到治疗作用的。动物实验表明,对NASH小鼠进行FMT可以显著降低体质量、体脂含量和血清转氨酶水平[29]。FMT可以改善IM紊乱,从而减少脂肪聚集,缓解肝脏脂肪变程度[30]。FMT可恢复肠道菌群多样性,增加拟杆菌门数量,减少放线菌门和厚壁菌门数量,促进丁酸盐产生,改善紧密连接功能和内毒素血症。FMT确实有降低NAFLD患者小肠通透性的潜力[31,32]。来自瘦型捐赠者的FMT改善了胰岛素敏感性[33]。FMT能够改善NAFLD患者肝组织脂肪变、肠黏膜屏障功能、脂肪代谢和IM谱等[29]。移植的健康IM的丰度和种属是否与疾病缓解程度呈正相关还有待进一步研究。当前,FMT还面临许多挑战。菌群供者究竟是从标准粪菌库中选择还是采用个体供者?将特征不明显的微生物材料引入患者体内是否存在风险,其中可能包括致病菌。未来还需要对提取方法、储存、给药和后期稳定性等进行大量研究。

2.3 噬菌体 肠道噬菌体是存在于人体肠道中的微生物,与IM相互调节发挥作用。通过研究细菌丰度及其组成变化,可使用特定细菌的噬菌体靶向根除该细菌,消除其对NAFLD患者的不利影响[34]。例如HiAlc-Kpn作为产乙醇菌,使用噬菌体靶向根除HiAlc-Kpn,便可以有效缓解NAFLD大鼠的疾病程度。研究表明,噬菌体在FMT治疗肠道相关疾病方面可能起着重要的作用,为精确修饰IM提供了一种可靠的方法。

2.4 中草药 中医自古有“肝与大肠相通”的说法。中医药调节NAFLD最常用的是具有清热、祛湿、补气等功效的中药,最具代表性的是黄连和人参,其有效成分分别为小檗碱和人参皂苷。动物实验研究发现,小檗碱能够改善NAFLD大鼠IM结构和菌属比例,增加肠黏膜上皮occludin蛋白表达,并通过激活胆汁酸受体及其通路相关蛋白表达,促进胆汁酸肝肠循环,最终起到调节IM和延缓NAFLD进程的作用[8]。采取宏基因测序法研究长期服用人参提取物的大鼠IM的变化,结果显示人参提取物能够增加肠道的有益菌群,而抑制有害菌群,从而通过调整IM来改善NAFLD的病情[35]。长期使用中草药或联合西药使用中草药也可能更好,将非常有助于开发新的中草药疗法或新的药物以改善NAFLD。