双酚A 及其类似物对鱼类骨骼发育的影响

高培洁，邓昊阳，段霖，张倩青，吴朗

（西北农林科技大学动物科技学院，陕西 咸阳 712000）

双酚类化合物是指具有2 个羟苯基结构的化学物质，包括双酚A（BPA）、双酚S（BPS）、双酚B（BPB）、四溴双酚A（TBBPA）等。其中，BPA 最为常见，近年来在河流、湖泊、沉积物、土壤等环境介质中被频繁检出[1]。研究表明，动物骨骼发育障碍疾病，与双酚类化合物污染密切相关[2]。水环境中广泛存在的BPA 等，可能通过鱼鳃呼吸、皮肤渗透等方式进入鱼体内，干扰鱼类骨骼代谢，影响骨骼发育，最终威胁其生存和种群维持。现简述BPA 及其类似物，对鱼类骨骼发育的毒性效应及相关机理，以期为BPA 及其类似物的生态风险评估提供理论依据。

1 BPA 及其类似物的来源和污染现状

BPA 及其类似物是生产聚碳酸酯和环氧树脂的原料，广泛应用于罐头内层、食品和饮料包装材料以及婴儿奶瓶等工业产品中，可通过水解作用，从这些产品中渗透出来，随废水排放，最终汇集到河流、湖泊等水域中[3]。

双酚类化合物的污染呈现全球性的特征。Yu等[4]在美国35 个州76 份工业废水样品中，均检测到了BPA、BPS、双酚F（BPF）、双酚AF（BPAF）等多种双酚类污染物。Yamazaki 等[5]在日本、韩国、印度主要河流中，也发现了BPA、BPS、BPF。我国黄河、长江、珠江等主要水域以及浙江、上海、江苏等沿海省份，也发现了多种双酚类化合物残留[6-8]。据统计，欧美及日本地表水中BPA 质量浓度一般为0.002~21.000 μg/L[9]，我国地表水中BPA 质量浓度一般为0.000 98~4.465 00 μg/L[10-11]，最高可达4 499 μg/L[12]。

鱼类等水生动物长期生活在水中，对BPA 及其类似物有较高的富集能力。Luigi 等[13]调查发现，意大利波河鲤（Cyprinus carpio）肝脏以及欧鳊（Abramis brama）、梭鲈（Sander lucioperca）和六须鲇（Silurus glanis），体内的BPA 质量比分别为53.1~204.1，58.9~1 529.6，36.6~392.2 和104.1~488.1 ng/g。我国太湖北部水域的BPA 质量浓度为22.5~194.0 ng/L，而田螺、河蚌和鱼类体内干质量比高达475 μg/kg[14]。一般来说，生物体内双酚类化合物富集程度与生物栖息环境的双酚类污染状况密切相关，在其污染较重区域，生物体对双酚类化合物的富集程度更高。例如，日本名古屋河流鱼类体内TBBPA质量比为0.01~0.11 ng/g[15]，而中国巢湖工业污染区鱼类体内TBBPA 质量比为28.5~39.4 ng/g[16]。

2 对鱼类骨骼发育的影响

BPA 是一种内分泌干扰物，可通过多种途径，直接或间接干扰生物骨骼代谢和发育[17]。对鱼类骨骼生长发育的影响，既可直接作用于鱼体本身，也可通过亲代传递给子代。

2.1 早期发育

动物试验表明，BPA 及其类似物，对鱼类骨骼发育具有不利影响，且在生命早期阶段表现尤为明显。Kramer 等[18]研究发现，BPA 聚合物（Bis-GMA）可损害斑马鱼（Danio rerio）胚胎软骨的骨化。任文娟等[19]研究了BPA 及其类似物对斑马鱼胚胎的心率、孵化率和7 d 体长的影响，结果表明，对于硬骨鱼类胚胎和仔稚鱼，BPP（双酚P）的毒性最大，其次是BPAP（双酚AP）、BPAF、BPZ（双酚Z），BPA、BPB 和BPF，BPS 的毒性最小。Moreman 等[20]也发现，BPA、BPS、BPF 和BPAF 均可影响斑马鱼幼苗骨骼发育，导致其脊柱弯曲、尾部弯曲和颅面异常等。

体外细胞试验[21]也表明，BPA（2.5~12.5 μm）暴露，可导致成骨细胞和破骨细胞前体细胞增殖速度降低，加剧成骨细胞和破骨细胞凋亡；荧光定量PCR 结果显示，在成骨细胞形成中具有关键作用的runx2、osterix、beta-catenin等基因的转录水平显著下降，而促凋亡相关基因bax和caspase-9 转录水平显著上升。此外，BPA 对金鱼体内的钙稳态也有影响。研究[22]表明，BPA 暴露，可降低金鱼血浆中钙水平，抑制降钙素分泌，扰乱体内钙平衡，从而可能影响其骨骼发育。

2.2 遗传毒性效应

BPA 及其类似物对鱼类骨骼发育的影响可能具有传代效应。研究[23]发现，稀有鲫（Gobiocypris rarus）亲本经BPA 暴露后，其子代角舌骨和下颌骨缩短，骨骼畸形率增加，同时软骨骨化延迟，生长速度延缓。在分子水平上，骨骼发育关键基因runx2、sox9、bmp2b等的转录水平均显著下调。斑马鱼亲本及子代胚胎经BPA 及其类似物暴露后，子代幼鱼软骨细胞异常增生，细胞排列拥挤、紊乱，且凋亡速度加快，最终导致咽颅软骨的角度及长度显著增大（长），呈现长头巨眼畸形[24]。

3 干扰鱼类骨骼代谢的机理

3.1 直接影响

鱼类骨骼的发育主要涉及软骨细胞、成骨细胞和破骨细胞的相互作用[25]。这些骨细胞的凋亡及分化，对于维持骨代谢的动态平衡具有重要意义[26]。研究[27]发现，BPA 及其类似物可通过多种信号通路，（如FoxO、RANKL/RANK、Wnt/β-catenin 等），调控参与骨形成和骨代谢的功能蛋白的表达，干扰骨细胞凋亡和分化，进而影响骨骼发育。

3.1.1 对FoxO 通路的影响

FoxO 通路在维持细胞内活性氧（ROS）活性、调节细胞凋亡和细胞自噬方面，起着至关重要的作用[28]。过量ROS 和氧化应激的产生，是诱导细胞凋亡的潜在因素。一旦过量的ROS 克服了抗氧化水平，就会产生氧化应激反应；丙二醛和8-羟基脱氧鸟苷过量，也会诱导成骨细胞产生氧化应激反应，进而导致细胞凋亡。斑马鱼亲本及胚胎经BPA 暴露后，BPA 可能通过激活FoxO 信号通路，造成活性氧的过度形成，诱导细胞凋亡，从而造成咽颅软骨发育受损[28]。BPA 诱导的氧化应激，已在多种鱼类中发现，如鲤和稀有鲫[29-31]。

3.1.2 对RANKL/RANK 通路的影响

核因子κB 受体活化素配体（RANKL）/RANK信号通路，可调控多核破骨细胞前体的形成和活化，进而帮助骨骼重建[32]。RANKL 是一种核因子kappa-b 受体激活因子配体，主要在成骨细胞和淋巴细胞中表达[33]。而RANK 是RANKL 的受体，多在破骨细胞中特异性表达，二者的结合，可以诱导破骨细胞成熟并增强其骨吸收的作用[34]。Hwang等[21]发现，BPA 可以抑制破骨细胞中RANK 的表达，并且下调RANKL 诱导的NFATc1、MAPK 和AKT等信号转录因子的表达水平，进而抑制破骨细胞的凋亡，干扰骨发育。

3.1.3 对Wnt/β-catenin 通路的影响

Wnt/β-catenin 通路在骨发育及骨重塑的过程中，不仅可以促进成骨细胞增殖和分化，而且可以通过影响RANKL-RANK-OPG 信号调节轴，间接调控骨吸收作用。研究[35]表明，Wnt/β-catenin 信号通路的激活，可以抑制RANKL 的表达，并上调骨保护蛋白（OPG）水平，进而抑制破骨细胞分化、成熟以及破骨细胞的骨吸收作用。研究[36]发现，BPA 可以通过破坏Wnt/β-catenin 信号通路来干扰骨骼发育。体外细胞试验[37]也表明，BPA（250 μm）可显著降低人骨髓干细胞（hBMSCs）中Wnt/β-catenin/LEF 通路的转录靶基因β-catenin 和细胞周期蛋白D1 的核水平，最终导致β-catenin 信号通路缺失，阻碍其发挥正常功能。

3.1.4 对BMP 信号通路的干扰

BMP 信号家族是转化生长因子β（TGF-β）超家族的一个多样化子集。BMP 与细胞表面的BMP受体（BMPR）结合。BMPR 由Ⅰ型受体和Ⅱ型受体组成。BMP 与BMPR 结合诱导Ⅱ型受体磷酸化并激活Ⅰ型受体。激活的Ⅰ型受体，可以通过受体调节蛋白SMAD 家族蛋白的磷酸化介导细胞内信号传递，使该蛋白能够定位于细胞核并调节基因表达[38]。当BMP 蛋白表达下降时，其介导的信号转导将无法进行，用于调控骨骼形成和修复的基因runx2、osx、bglap2 和col1a1 的表达量也同步下降[39]。在斑马鱼骨骼生长发育的过程中，腹弓外胚层表达bmp4，颅面表达bmp2，咽内胚层、外胚层表达bmp5和bmp7a/b[40]。研究[41]发现，组合敲除bmp2 和bmp4，或者组合敲除bmp2 和bmp7，都会导致成骨细胞分化异常。Fan 等[23]通过稀有鲫的遗传毒性试验发现，将雌性亲代暴露于BPA 中，子代bmp2、bmp4、bmp6 的表达均显著下降，同时出现软骨畸形和生长发育迟缓的现象。上述研究结果表明，BPA可通过减弱BMP 介导的信号传导作用，进而干扰骨骼发育[23]。

3.2 间接影响

3.2.1 干扰性激素正常功能

雌激素、黄体酮和雄激素等性激素是骨代谢的关键调节剂。黄体酮和睾酮可促进成骨细胞增殖和分化，雌激素则可抑制破骨细胞分化，促进破骨细胞凋亡和诱导成骨细胞生成[33]。

BPA 可与性激素相关受体结合，干扰内源性激素的稳态，抑制成骨细胞分化并诱导细胞凋亡，降低血浆钙水平，进而影响骨骼发育[17]。例如，BPA 可竞争性地与雌激素受体ERγ 结合，抑制骨形态发生蛋白2（BMP-2）诱导的成骨细胞分化、骨钙素表达、碱性磷酸酶（ALP）活性以及骨矿化，进而导致骨丢失和骨质疏松[2]。在对金鱼（Carassius auratus）的研究中，BPA 也表现出雌激素拮抗作用，导致血浆中钙水平和ALP 活性降低[22]。黄文龙[24]也发现，BPA可通过与雌激素受体、雄激素受体或雌激素相关受体结合，干扰斑马鱼咽颅软骨发育。

3.2.2 干扰神经递质受体表达

神经递质对调节动物体的运动行为具有重要作用，而双酚类化合物能够通过干扰神经递质受体表达，间接影响骨骼发育。研究[42]发现，神经递质γ-氨基丁酸（GABA），可通过提高成骨基因mRNA 的表达、ALP 活性和钙离子的吸收，从而促进成骨细胞分化；一旦GABA 缺乏，将导致颅面骨骼发育异常[43]。Imanishi 等[44]报道，BPA 在大鼠体内可与γ-氨基丁酸（GABA）受体作用，抑制GABA 反应。

3.2.3 干扰免疫系统

骨健康水平下降与炎症和氧化应激有关，接触BPA，可能对骨骼产生退行性影响[45-46]。Gascon 等[47]发现，孕妇产前接触BPA，可能影响后代Th1 淋巴细胞和Th2 淋巴细胞活性，进而影响先天性免疫系统。Monasterio 等[48]指出，Th1 淋巴细胞可以通过产生IL-1β、IL-12、IFN-γ，增强成骨细胞和Th17 淋巴细胞上的RANKL 表达，间接发挥破骨细胞活性，促进骨基质吸收。鲤长时间暴露于BPA 中，可导致体内大量ROS 产生并积累，从而造成T 细胞的死亡[49]，进而影响机体的骨稳态。

4 结语

BPA 及其类似物在水环境中广泛存在，其对鱼类等水生动物骨骼发育的影响不容忽视。目前，关于低剂量双酚类化合物骨骼毒性效应的试验证据仍不充分，其影响程度因种属、暴露时间和暴露方式等不同而异，其作用机理多样且不完全明确，仍需要开展更多针对不同类型水生动物骨骼毒性的相关研究。另外，不同代谢形态的双酚类化合物，对水生动物的毒理效应及机理可能不同，因此，可选取对污染物比较敏感的水生动物[如稀有鲫、剑尾鱼（Xiphophorus helleri）等]的生理生化、基因表达等指标为标志物，探究在水生生物体内，双酚类化合物不同代谢形态与其毒理效应之间的关系，进而相对完整地评价双酚类化合物的生态风险。

在自然水体中，双酚类化合物的污染常伴随多种环境污染物存在。目前，国内外的研究多为单一双酚类化合物的毒性效应，而关于其他污染物的联合毒性效应方面的研究报道较少。在后续研究中，一方面可以模拟现实水环境的污染水平，重点研究水环境中双酚类化合物与其他常见污染物（如抗生素、重金属离子等）的联合毒性；另一方面，完善野外采集的水体理化指标和水生生物相关毒性指标的数据库，综合评价水环境中双酚类的生态毒理效应。