交叉置换扩增联合纳米生物传感器检测乙肝病毒方法的建立与应用

贾 楠,肖 飞,周 娟,伏 瑾,黄小兰,陈 敏,黄 辉,王 毅

(1.首都儿科研究所 实验中心,北京 100020 ;2.首都儿科研究所附属儿童医院 感染科,北京 100020)

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)是导致乙型肝炎的重要病原体,可在分娩时通过母婴垂直传播感染新生儿,或通过接触感染的血液或体液导致家庭内传播。HBV感染可引起急性或慢性肝脏损伤,严重者可导致肝功能衰竭、肝硬化、肝癌等。据世界卫生组织(world health organization, WHO)统计,截至2019年,全球约有2.96亿人曾感染过HBV,约82万人死于乙型肝炎引起的并发症[1]。我国是HBV感染的高负担国家,国家卫健委疾控局发布的《2021年全国法定传染病疫情概况》显示,病毒性肝炎(乙型肝炎约占80%)依然是中国法定报告传染病中报告病例数第一的乙类传染病[2]。HBV感染是严重的全球性公共卫生问题之一,然而,全球仅有10%的感染者接受过HBV检测诊断,知晓自己的感染状况[1],我国也仅有18%的乙肝患者被诊断。因此,建立快速、准确、灵敏、特异的HBV检测方法对加快HBV感染诊断具有重要意义。

目前针对HBV的检测方法主要有两类[3],一类是基于酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)、化学发光免疫分析(chemiluminescence analysis, CLIA)技术以及胶体金法等对血清中HBV相关抗原抗体的检测[4-5],另一类是基于聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)对HBV DNA的检测[6]。ELISA方法是临床上应用最广泛的检测HBV感染方法,但由于HBV感染还存在窗口期感染、隐匿性感染、抗原表位突变、血清学转换等情况,该方法在这些异常情况下灵敏度较低,无法有效检出HBV[7]。基于PCR方法检测HBV具有灵敏、快速的特点,能够有效缩短血清转换前的检测窗口期,从而提高隐匿性HBV感染的检出率[8],但此类方法多需要昂贵的仪器设备、技术熟练的操作人员以及较好的实验条件,且结果判定方法较为复杂,因而很难在经济落后的地区推广应用。因此,建立高灵敏度、低成本、简单快速准确的HBV诊断技术对HBV感染的预防和早期发现具有重要作用。多交叉置换扩增(multiple cross-displacement amplification, MCDA)是一种新型的恒温核酸扩增技术,具有较高的检测灵敏度,目前已用于多种病原体的检测[9-11]。金纳米颗粒侧向流动生物传感器(label-based gold nanoparticles lateral flow biosensor, LFB)具有优良的特异性和灵敏性,可用于核酸等生物大分子的可视化检测[12]。本研究尝试将MCDA与LFB方法结合,建立一种准确快速、简单灵敏的HBV检测方法,同时评价HBV-MCDA-LFB在临床样本中的检测效力。

1 材料与方法

1.1 试剂和仪器 可视化检测试剂(visual detection reagent, VDR)、LFB和Loopamp®DNA扩增试剂盒购自天津汇德新生物技术有限公司;引物和标记引物由北京奥科生物科技有限公司合成;核酸内切酶Nb.BsrDI购自北京新英格兰生物实验室;DNA提取试剂盒(easypure blood genomic DNA Kit)购自北京全式金有限公司;HBV RT-PCR诊断试剂盒购自湖南圣湘生物科技有限公司;实时浊度仪LA-320C购自日本东京艾肯化学有限公司。

1.2 菌株与临床样本 HBV质粒(北京奥科生物技术有限公司合成)、2份HBV阳性的临床核酸样本以及19株非HBV病原体被用于本研究(表1)。83份疑似HBV感染患者的血浆样本来自贵州中医药大学第二附属医院及首都儿科研究所。19株非HBV病原体和83份血浆样本用DNA提取试剂盒提取核酸后备用。本研究通过首都儿科研究所伦理委员会伦理审批(NO:SHERLL2019012)。

表1 本研究所使用的菌株信息

1.3 金纳米颗粒侧向流动生物传感器的制备 LFB(大小:60 mm×4 mm)按照既往描述的方法[13]稍做修改进行制备。具体操作如下:首先将样品垫、结合垫、硝化纤维素膜(NC膜)和吸收垫依次贴于塑料粘胶垫板上,然后分别将抗荧光素抗体(anti-FAM, 0.15 mg/mL)和生物素偶联的牛血清蛋白(biotin-BSA,2.5 mg/mL)喷涂于NC膜上作为检测区(test line, TL)和质控区(control line, CL),两区之间间隔5 mm,最后将金纳米颗粒偶联的链霉素亲和素(SA-GNP)置于结合垫上。将组装好的LFB装入塑料盒中,放入干燥剂,置于阴凉干燥处避光保存,有效期为18个月。

1.4 引物设计 本研究以HBV的特异性S基因(genbankaccession No.AB809557.1)为检测靶标,使用PRIMER PREMIER 5.0软件设计MCDA-LFB的扩增引物。引物位置如图1所示,引物序列及相关修饰如表2所示。

引物位置用下划线和彩色文本标识;引物的有义序列和互补序列分别用左右箭头标识。

表2 HBV特异性S基因MCDA-LFB引物序列及相关修饰

1.5 HBV-MCDA检测的标准化 HBV-MCDA的反应体系为25 μL,包括:12.5 μL的2×反应缓冲液,置换引物(F1、F2)各0.1 μmol/L,交叉引物(CP1、CP2)各0.4 μmol/L,扩增引物(C1、C2、D1、D2、R1和R2)各0.2 μmol/L, 1.0 μL Bst DNA聚合酶(8 U), 1 μL Nb.BsrDI(10 uU), 1 μL(纯菌)或5 μL(临床样本)DNA模板,补加蒸馏水(distilled water, DW)至25 μL。HBV质粒为阳性对照,HCV为阴性对照,DW为空白对照。扩增结果利用可视染料颜色变化法和LFB法进行检测判别。反应管颜色变为蓝色和LFB的TL区和CL区均出现红色线,视为阳性结果。

1.6 HBV-MCDA最佳反应条件验证 HBV-MCDA反应温度优化的方法是:分别在57～64 ℃(间隔1 ℃)8个温度条件下扩增40 min,然后95 ℃加热5 min终止反应。试验以HBV质粒为阳性对照,DW为空白对照;使用实时浊度仪(LA-320C)监测反应过程,以浊度>0.1作为阳性结果的阈值。通过比较不同反应温度条件下扩增效率(出峰时间以及峰值高低)从而确定最佳反应温度。

HBV-MCDA反应时间优化的方法是:利用LFB方法分别在HBV-MCDA反应的第10～40分钟(每隔10分钟)检测扩增产物的结果。每个扩增时间至少重复2次。以最早检测出检测限(limit of detection, LoD)水平模板的时间为最佳反应时间。

1.7 HBV-MCDA-LFB检测的灵敏度和特异性分析 将HBV质粒从1×105拷贝进行10倍梯度稀释至1×10-1拷贝,用于分析HBV-MCDA-LFB方法的检测限和灵敏度。利用1份HBV质粒、2份HBV阳性核酸样本和19株非HBV病原体(表1)的DNA模板分析HBV-MCDA-LFB方法的特异性。实验以DW为空白对照,并使用可视染料颜色变化法和LFB法进行扩增结果检测。所有实验至少重复2次。

1.8 HBV-MCDA-LFB检测在临床标本中的检测能力分析 83份疑似HBV感染患者的血浆样本为贵州中医药大学第二附属医院及首都儿科研究所收集所得。所有样本均在参与者监护人的知情同意下采集,且首次用于临床和实验室诊断。所有样本同时利用HBV-MCDA-LFB和RT-PCR 2种方法进行检测,并采用R软件(4.3.0版)分析2种方法检测结果的一致性。

2 结果

2.1 HBV-MCDA引物的有效性及标准化方法的建立 基于表2所示引物进行MCDA扩增,利用可视染料颜色变化法、LFB法、实时浊度仪法检测扩增产物,结果显示HBV质粒模板为阳性,HCV和DW均为阴性(图2)。结果提示本研究所用的MCDA引物在HBV-MCDA-LFB检测中是有效的,该引物将用于后续的验证实验。

A:可视染料颜色变化方法检测结果;B:LFB方法检测结果;C:实时浊度仪法检测结果;1号管/条/浊度曲线模板为HBV质粒,检测结果阳性,2、3号管/条/浊度曲线模板为HCV和DW,检测结果为阴性;CL:控制线;TL:检测线;横坐标为检测时间,纵坐标为实时浊度。

2.2 HBV-MCDA最佳反应条件验证 如图3所示,60 ℃条件下HBV-MCDA的扩增效率最高且速度最快。因此,60 ℃为HBV-MCDA方法的最佳反应温度。本研究中的后续验证实验均在60 ℃进行。

横坐标为检测时间,纵坐标为实时浊度;A～H:检测温度依次为57～64 ℃。

在HBV-MCDA的扩增时间为30 min时,LoD水平(1×101拷贝,敏感性实验结果)的模板能够被检出(图4C)。因此,30 min是HBV-MCDA-LFB的最佳检测时间。

A、B、C、D: LFB 分别在HBV-MCDA反应10、20、30、40 min后检测扩增产物;1～6号条的模板为浓度为1×105拷贝～1×100拷贝的HBV质粒,7号条的模板为蒸馏水;CL:控制线;TL:检测线。

2.3 HBV-MCDA-LFB检测的敏感性和特异性验证 HBV-MCDA-LFB方法的敏感性评估结果如图5所示,其LoD为1×101拷贝。特异性评估结果如图6所示,HBV质粒和2个HBV阳性临床样本的MCDA的扩增结果均为阳性,其他病原体的扩增结果均为阴性。

HBV-MCDA-LFB方法的特异性分析通过可视染料颜色变化、LFB检测扩增结果;1号管/条的模板为HBV质粒;2、3号管/条的模板为HBV阳性的临床核酸样本,4～22号管/条的模板为非HBV病原体;BC的模板为蒸馏水;CL:控制线;TL:检测线。

2.4 HBV-RT-MCDA检测在临床标本中的可行性评价 在83份疑似HBV感染患者的血浆样本中,RT-PCR方法检出45例阳性样本,这些阳性样本同样被HBV-MCDA-LFB方法检出(图7)。此外,另有3份RT-PCR阴性的样本被HBV-MCDA-LFB方法检出。经R软件计算(表3),RT-PCR和HBV-MCDA-LFB 两种方法的χ2值为0.097 805,P值为0.754 5,表明两种方法的检测能力没有差异,具有较高的一致性。

利用HBV-MCDA-LFB检测83份疑似HBV感染患者的血液样本;CL:控制线;TL:检测线。

表3 HBV-MCDA-LFB和RT-PCR在临床样本中的HBV检测能力的比较(n=83)

3 讨论

病毒性肝炎是我国法定报告传染病报告病例数最多的乙类传染病,其中约80%的病例是由HBV感染引起的[2]。据统计,我国现有HBV携带者约7 000万人,其中约2 800万为慢性感染者,这些慢性感染者发生肝硬化、肝衰竭和肝癌的风险较高,最终可能导致约70万人死亡[14]。HBV感染引起的病毒性肝炎是我国主要的卫生挑战。因此,建立快速准确、灵敏特异的HBV检测方法对我国预防、治疗和控制HBV感染具有极其重要的作用。

近年来,随着分子生物学技术的发展,核酸扩增检测(nucleic acid amplification test, NAT)技术因其灵敏度高、时效性好的特点在病原体检测领域得到了广泛应用。研究发现,HBV DNA是病毒复制和传染性的直接标志,在HBV感染后1个月即可检出HBV DNA[15],因此HBV DNA检测在HBV感染的控制、诊断和治疗评价中具有重要的应用价值[16-17]。实时荧光定量 PCR 技术是目前临床最常用的HBV DNA检测技术[18],然而,由于该方法需要昂贵的扩增仪器以及严格的实验条件,且在极低浓度HBV DNA情况下容易出现漏检的情况[19-21],因此无法在条件有限的基层和偏远地区以及病毒载量极低的感染者中普及应用。

恒温核酸扩增是近几年迅速发展且不依赖特殊实验设备和条件的核酸检测技术[9],包括MCDA[9],环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)[22-23]、重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification, RPA)[24-25]等。与以PCR为基础的核酸扩增检测方法相比,恒温核酸扩增技术不需要高温的模板热变性过程,长时间的温度循环以及繁琐的电泳检测扩增结果,其扩增可以在较低的恒定温度下实现,扩增产物的检测可通过实时浊度仪、可视化染料或侧向免疫层析法实现,因此具有快速、简单、高特异性、高灵敏度、成本低廉的优点,在床旁检测(point-of-care test, POCT)等领域具有强大的应用前景[26]。本研究中所用的MCDA方法就是这样一种新型等温扩增技术[9]。目前,MCDA方法已经用于SARS-Cov-2、猴痘等新发突发传染病的检测[27-28]。MCDA方法在恒温条件下仅使用1种恒温置换酶(Bst2.0)就可以实现核酸扩增,具有扩增度快、反应灵敏、特异性高的特点[9-10]。在MCDA方法中,分别针对靶基因的10个区域的5对扩增引物保证了该方法较高的特异性,经验证,本研究中HBV-MCDA-LFB方法的特异性为100%。除了特异性高外,HBV-MCDA-LFB方法还具有高灵敏性的特点[10]。在本研究中,HBV-MCDA-LFB方法在30 min内即可检测到浓度低至10个拷贝的HBV质粒。与Chen等[29]的报道相比,本研究在确保检测灵敏度的同时,将检测时间从35 min缩短至30 min,提示其较高的扩增效率。同时,在临床样本的检测能力评估中,HBV-MCDA-LFB方法的HBV检出率也略高于RT-PCR,证明了HBV-MCDA-LFB方法的检测能力与RT-PCR方法具有较高的一致性,可用于疑似HBV感染者的筛查和诊断。

金纳米材料具有超强的吸附能力、良好的定向能力和生物兼容性,基于金纳米材料的生物传感器在医学诊断、临床检测等领域具有广泛的应用[27, 30-31]。本研究将LFB技术与MCDA方法相结合,能够实现HBV的简单、快速、准确检测。MCDA的扩增产物可以用多种方法进行分析检测,包括琼脂糖凝胶法、比浊法和可视颜色变化法等[10-11]。然而,这些检测方法需要特定的仪器进行识别判读,或者敏感性较低,容易产生假阴性结果。利用LFB方法检测MCDA扩增产物,不需要昂贵的仪器设备和复杂的操作过程,同样可以实现MCDA产物的可视化检测,同时还有较高的灵敏度和特异性。

然而,本研究建立的HBV-MCDA-LFB方法也存在一定的局限性,如无法对样本中的HBV载量进行准确定量、存在交叉污染的风险等,这些缺陷将在未来的研究中进行优化和改良。总之,本研究研究建立的HBV可视化检测方法HBV-MCDA-LFB具有快速准确、灵敏特异和操作简单的优点,在临床检测和HBV感染诊断中具有良好的应用前景,尤其是在医疗资源匮乏的偏远地区。