应用二代测序技术初探顺铂在肺癌耐药的相关机制

徐亮亮 廉政君 郭倩茹 陈存存 周明杰 陈志祥

肺癌(lung cancers,LC)严重危害人类健康[1]。由于肺癌临床症状的不典型以及现有诊疗手段的局限性,大多数患者就诊时已经是中晚期,丧失手术机会,所以化疗仍然是肺癌治疗的主要手段之一[2]。目前肺癌标准化疗均是以顺铂为基础的联合方案,但耐药性的出现仍然是顺铂临床应用的重要限制因素[3-4],因此迫切需要识别和探索耐药基因,从而逆转顺铂耐药。转录组测序可以在短时间内检测出上千种基因表达,对药物作用后组织或细胞功能性变化进行概括性描述。较多研究已证实PI3K/AKT/mTOR通路与药物耐药密切相关[5-6],抑制mTOR通路相关靶点,可以逆转细胞毒药物的耐药性并达到联合用药协同增效作用[7],是提高化疗敏感性的有效策略。

资料与方法

一、材料

收集2021年7月至2022年7月新疆医科大学第八附属医院手术获取的肺组织,共20例,其中10例为顺铂治疗后未出现复发及进展的肺组织及癌旁组织,10例为顺铂化疗过程中或应用顺铂化疗后一年内出现局部复发或远处转移的患者,考虑为对顺铂耐药。所有肺组织经病理明确诊断,患者均签署知情同意书,研究方案经医院伦理委员会批准[(2021)伦审003)]。

二、方法

1 转录组测序(RNA-seq) 分别抽取原发初治肺癌组织3例,复发性顺铂耐药肺癌组织3例,提取组织RNA进行RNA-seq测序,RNA收集于冻存管内,立即放入液氮3～5秒速冻,并于-80℃冰箱保存,随后放入干冰箱内寄于成都佩晨子生物科技有限公司进行数据监测及分析。

2 基因组富集分析(GSEA) 应用GSEA(https://www.gsea-msigdb.org/gsea/index.jsp)识别耐药组织与非耐药组织之间差异基因集。通过GSEA软件(4.2.3版)富集RNA-seq检测获得的基因,参考基因集使用分子特征数据库(MSigDB)中的50个标志性基因集(h.all.v2022.1.Hs.symbols.gmt)作为对照基因集,变化的数量被设定为1000次,P值小于1%和错误发现率(FDR)小于1%被认为具有统计学意义。

三、统计学分析

所有数据采用SPSS 19.0 和Graphpad prism 7.0软件进行分析及作图,组间率的比较采取Fisher确切概率法。所有统计学分析均以P<0.05为差异具有统计学意义。

结 果

一、肺癌患者的临床相关性分析

对已收集的20例肺癌标本的患者临床信息组间差异性分析,结果如(表1)所示,患者年龄、性别、病理分型和临床分期之间的差异均无统计学意义(P>0.05)。

表1 肺癌患者临床特征[n(%)]

二、通过RNA-seq测序分析耐药组织与非耐药组织间差异基因分析

本研究利用转录组测序对耐药组织与非耐药组织间差异基因进行分析检测,具有统计学意义的差异基因有662个(FC >1.5,P<0.05)。为了确定在耐药组织与非耐药组织间被明显激活的信号通路,利用GSEA软件分析,根据P值<0.05选择最明显富集的信号通路,如(图1)所示,四个通路发生重要改变:凋亡、DNA修复、NF-κB通路、PI3K-AKT-mTOR通路。

图1 耐药组织与非耐药组织间基因组富集分析(GSEA)结果A:凋亡;B:DNA修复;C:NF-κB通路;D:PI3K-AKT-mTOR通路

三、信号通路中差异基因表达

对耐药组织与非耐药组织间转录组数据发现差异基因进行通路富集发现凋亡、DNA修复、NF-κB通路、PI3K-AKT-mTOR通路发生显著改变,对通路中显著差异变化基因进行挖掘,热图展示各通路变化基因(图2),凋亡通路中CDKN1A、PRE1、GPX3、HMOX1、FASLG基因变化显著,DNA修复通路中DDB2、RAD51、POLA2及NT5C3A基因发生显著改变,NF-κB通路中CDKN1A、FASLG等基因以及PI3K-AKT-mTOR通路CDKN1A、DUSP5、DDX58、TRAE1等基因发生显著变化。

图2 热图展示各通路差异基因A:凋亡通路差异基因;B:DNA修复通路差异基因;C:NF-κB通路差异基因;D:PI3K-AKT-mTOR通路差异基因

四、基因本体论(GO分析)

根据差异基因进行信号通路富集分析,基因本体论(Gene Ontology, GO) 功能可用于对差异基因进行富集分析。GO功能分析发现血管内皮改变、凋亡及细胞黏附发生主要改变(图3)。

图3 GO功能分析耐药组织与非耐药组织间发生通路富集分析

讨 论

顺铂耐药的发生是肺癌治疗失败的主要原因之一。在本研究中,我们收集了初诊为II～III期的非小细胞肺癌患者组织标本,患者术后行顺铂化疗,化疗期间出现病情进展的组织视为耐药组织,1年内未出现复发及转移的组织为非耐药组织,对两组组织进行转录组mRNA-seq测序,利用生物信息学方法深入分析原始数据,鉴定了显著变化的差异基因,使用STRING网站来搜索发现细胞侵袭与迁移、细胞黏附和凋亡发生主要改变,耐药组织具有更强的侵袭与迁移能力,细胞黏附与耐药密切相关。

我们通过GO分析及基因组富集分析(GSEA)发现PI3K-AKT-mTOR-NF-κB 通路发生显著改变。有研究发现新型抗肿瘤药物化合物C与顺铂联合用药可以通过抑制PI3K-AKT-mTOR-NF-κB通路发挥协同抗卵巢癌作用,逆转顺铂耐药[8]。在多种恶性肿瘤中已观察到顺铂可以诱导EGFR激活,其激活的程度可能影响癌细胞对化疗的敏感性[9-11]。在EGFR的激活过程中,会发生EGFR二聚体化和多个酪氨酸的磷酸化,触发PI3K/AKT/mTOR、NF-κB、STAT和RAS/RAF/MEK1/ERK1/2等通路的激活[12-13]。此外,顺铂诱导的NF-κB的激活导致顺铂耐药,这在膀胱癌相关研究中已被证实[14-15]。PI3K/Akt通路在顺铂耐药中起到重要作用,过度激活的Akt通路会下调肿瘤抑制蛋白,促进细胞异常增殖,抑制细胞凋亡从而导致肿瘤的发生。Akt的过度活化也能使高分化的结肠癌向低分化转化,与肿瘤的不良预后有关[16],通过降低EGFR和NF-κB的激活水平,可以提高顺铂治疗疗效[17]。

综上所述,本研究收集临床组织标本后进行二代基因测序,利用GSEA富集分析发现,顺铂在肺癌中耐药的机制可能与细胞较强的侵袭转移等生物学过程,以及PI3K-AKT-mTOR通路有关。顺铂耐药是由多因素多步骤所致,包括药物在体内吸收和转化的改变,药效下降和药物靶标的突变。转录组测序技术的应用,使我们能够更有效地在功能上发现与顺铂耐药相关的通路及基因。相关机制仍然需要进一步研究和大量实验验证。