局部应用增生平水相提取物对实验性口腔癌预防作用的研究*

张红利，马兆峰，王嘉祺，孙正，关晓兵

口腔癌是临床上较为常见的恶性肿瘤之一，其中部分由潜在恶性病变如口腔白斑和红斑发展而来[1]。而白斑和红斑在组织病理学上通常伴有不同程度的上皮异常增生，这也是口腔黏膜癌前病变最基本的特征，是由正常上皮细胞向癌细胞转化的过渡阶段[2]。如果能在这个阶段使用药物抑制口腔肿瘤的发生发展，即利用天然或合成的化合物阻断、逆转或延迟浸润性癌的发生达到癌症的化学预防作用[3]，这将是很值得研究的。

“增生平”是由山豆根、拳参、败酱草、白鲜皮、夏枯草、黄药子六味中药组成的中成药制剂。最初应用于食管癌高发地区河南省林县、河北省磁县的食管癌前病变的阻断治疗并取得显著疗效，经临床观察证实服用增生平3～5 年，可使食管癌前病变（重增）的人群食管癌发生率下降50%左右，有效控制了食管癌的发生[4]。

本团队一直致力于研究增生平对口腔癌的化学预防作用，在DMBA 诱导的金黄地鼠颊癌模型中，增生平灌胃组显著降低了肿瘤数目及体积，抑制了口腔癌的发生，同时在4-硝基喹啉-1- 氧化物(4NQO) 诱导的小鼠舌癌模型中，增生平(10%膳食)也显著降低了舌癌的发生率，由55.2% 降至22.2%。此外，在一项针对口腔白斑患者的随机临床试验中，ZSP 口服组与安慰剂组相比显著降低了口腔病变的大小，动物实验和临床实验中都证实增生平对口腔癌有很好的化学预防作用[5]。然而，长期口服使用增生平可能会引起严重肝毒性[6]。考虑到口腔解剖位置特殊，利于局部给药，因此，将增生平改为局部用药，可以提高用药的有效性、安全性，减少药物的用量，更加有利于药物的治疗效果。我们根据增生平的化学成分进行提取、分析，保留药物的有效成分，去除毒性部分，得到四种提取物甲醇相（methanol fraction），丁醇相（n-butanol fraction），水相（water fraction），乙酸乙酯相（ethyl acetate fraction），通过动物实验发现丁醇相（n-butanol fraction）（4g/100ml）和 水相（water fraction）（1.4g/100ml），在口腔癌组织中具有抑制肿瘤细胞增殖和促进细胞凋亡的作用，肿瘤体积分别减少32.6%和22.9%[7]。本研究目的是为进一步证实局部应用低浓度增生平水相提取物对口腔癌依然具有良好的化学预防作用，以期获得作用大、毒性小的口腔癌化学预防药物。

1 实验与方法

1.1 动物模型的建立 本研究已通过首都医科大学附属北京口腔医院实验动物伦理委员会批准（伦理审批号：KQYY-2012030301）。购入130 只雄性金黄地鼠（6～8 周龄、平均体重135 g），常规饲养1 周后随机分为5 组。按照从增生平原药中提取出的不同成分（甲醇相、丁醇相、水相、乙酸乙酯相）的比例，提取物水相原始浓度为1.4g/100 ml，进行动物实验证实水相提取物（1.4g/100 ml），在口腔癌组织中具有抑制肿瘤细胞增殖和促进细胞凋亡的作用，基于此剂量，我们依次降低水相提取物浓度，设置局部应用增生平水相提取物低剂量组（0.35g/100 ml），中剂量组（0.7g/100 ml），高剂量组（1.4g/100 ml）各30只，阴性对照组10 只，阳性对照组30 只。阴性对照组不做任何处理，其余各组0.5% DMBA 溶液涂于地鼠左侧颊囊，每周3 次，连续涂6 周后阳性对照组不再做处理，低、中、高剂量组涂抹相应浓度的增生平水相提取物18 周。DMBA 诱导的地鼠颊囊口腔癌模型是经典的动物模型，一般在6 周时就会出现轻、中、重度异常增生（癌前病变）及原位癌（鳞癌的早期阶段）的病理表现[8-9]，而本实验的设计目的是研究药物在癌症发生的早期阶段的阻断作用，即癌症的化学预防作用，因此设计在6 周后进行药物干预。

在实验结束24 周时，断髓处死动物，取左侧颊囊组织，首先观察并记录颊囊组织标本的损害状态，然后沿长轴纵向分割成两部分，一部分固定在10%的福尔马林溶液中，用于HE 染色及免疫组织化学染色；另一部分置于-80 度低温冰箱中保存，用于western blotting 的检测。

1.2 口腔肿瘤发生情况 实验结束后处死动物，记录各组肿瘤发生情况、肿瘤数目及每个肿瘤的长、宽、高，取其平均值作为肿瘤半径（r），计算各组平均瘤体积（瘤体积=4/3πr3，单位mm）

1.3 组织病理学观察 颊囊组织固定于10%中性福尔马林24 h 后取出，卷成筒状，自动脱水机脱水，分切成5-6 mm 长的条状，石蜡包埋，每个样品切25 张4 um 切片，取第1、10、25 张进行HE染色，光镜下观察病理改变，并记录不同病变数目。病理改变分为口腔黏膜上皮单纯增生、轻-中度异常增生、重度异常增生-原位癌和浸润癌。上皮异常增生参照世界卫生组织（WHO）（2005）分类标准进行诊断[10]。

1.4 细胞增殖指数分析 实验结束动物处死前2 h 腹腔注射50 mg/kg 的5-氟脱氧尿嘧啶（BrdU，Sigma-aldrich 公司，美国）采用免疫组化Envision二步法检测，在第2、9、24 张玻片上随机选取正常黏膜、轻-中度异常增生，重度异常增生-原位癌和浸润癌中的4 个区域，400 倍显微镜计数阳性细胞数，作为BrdU 增殖指数即细胞增殖指数。

1.5 Bcl-2 蛋白表达的分析 利用western blotting检测低温冷冻保存的地鼠颊囊组织Bcl-2 蛋白的表达，将剪碎的组织裂解摇匀，4℃，13 000 rcf，离心10 min。取上清，上清即为总蛋白。用BCA 法计算蛋白浓度，聚丙烯酰胺凝胶电泳湿转的方法完成蛋白转运，用β-actin 作为内参蛋白完成抗原封闭及抗体杂交，用化学发光法检测PVDF 膜上阳性信号制成胶片，将胶片扫描成图像文件，用Gel-Doc 凝胶成像系统，通过Image J 图形分析软件计算单位光密度值和条带面积，将各实验点的总光密度值与内参比较，得到相对灰度值。

1.6 统计学分析 应用SPSS18.0 for windows 统计进行统计分析，数据用mean±SD 表示，检验以a=0.05 作为检验水准。

（1）采用秩和检验（Rank-Sum Test）进行不同组间平均瘤数目及平均瘤体积比较。（2）采用单因素方差分析（one-way ANOVA）检验BrdU 增殖指数，LSD 两两比较。（3）采用单因素方差分析Bcl-2 蛋白的表达灰度值差异。

2 结 果

2.1 口腔黏膜肿瘤发生率及组织病理学分析 正常金黄地鼠颊黏膜为淡粉色、光滑、菲薄、有弹性，黏膜下血管清晰可见。实验第1 周至第6 周涂0.5%DMBA 期间，地鼠颊囊黏膜炎症明显，伴出血化脓。6 周以后，地鼠颊囊黏膜炎症逐渐加重，部分地鼠颊囊可见增生物，为球形、乳头状或菜花状，有蒂或无蒂，表面充血或有脓性分泌物，呈红黄色相间状，其中阳性对照组炎症明显比各用药组严重，用药组颊囊瘢痕挛缩明显(图1)。

图1 肿瘤大体观察情况

高剂量组和中剂量组肉眼肿瘤发生率由88.9%（阳性对照组）分别下降为78.9% 和83.3% (表1)。高剂量组显著降低了上皮单纯增生病灶数目（P ＜0.05）；低、中、高剂量组显著降低了轻-中度异常增生的病灶数目（P ＜0.05）(表2、图2)。

表1 肿瘤发生情况

表2 病理结果

图2 病理结果

2.2 细胞增殖指数 低、中、高剂量组的细胞增殖指数在癌旁正常黏膜和轻-中度异常增生中与阳性对照组相比有非常显著差异（P ＜0.01)，且中剂量组与高剂量组组间具有非常显著性差异（P ＜0.01)。在浸润癌中，中、高剂量组与阳性对照组相比具有显著性差异（P ＜0.05)(表3，图3)。

表3 细胞增殖指数

图3 BrdU 增殖指数免疫组化结果（×400）

2.3 Bcl-2 蛋白表达水平 低、中、高剂量组Bcl-2蛋白的表达较阳性对照组依次降低，中剂量组与阳性对照组相比，有显著性差异（P ＜0.05)；高剂量组与阳性对照组相比，有非常显著差异（P＜0.01)(图4)。

图4 Bcl-2 蛋白表达水平

3 讨 论

增生平是一种传统中药，通过对其药理研究发现，增生平有调节免疫反应，抑制炎症细胞因子的产生和抑制食管上皮肿瘤发生的作用[11]。这与我们的研究结果是一致的，各用药组在整个过程中炎症反应明显较阳性对照组轻，进一步证实了增生平的抗炎作用。此外，之前的实验发现，环氧化酶或5-脂氧合酶抑制剂作为抗炎剂，通过抑制异常的花生四烯酸代谢，阻止口腔鳞状细胞癌的发生发展[12-13]。那么增生平水相提取物的抗癌作用是否也是由此通路实现，还需要进一步研究。

肉眼观察结果中，与阳性对照组比较，中剂量组及高剂量组肉眼肿瘤发生率由88.9%（阳性对照组）分别下降为83.3%和78.9%，虽无统计学差异，但提示增生平水相提取物的局部应用对肿瘤的发生是有抑制作用，并且有一定的剂量依赖性，浓度越大，作用越明显。而前期动物实验多为将增生平进行地鼠颊癌模型灌胃或在小鼠舌癌模型中加入10%膳食[5]，这些模型可认为是口服给药的一种模式，而本实验考虑口腔解剖位置特点，设为局部给药，创新了增生平用药的方法并证实可行有效，为后续药物转化奠定了基础。

病理结果显示，高剂量组显著降低了上皮单纯增生病灶数目（P ＜0.05）；低、中、高剂量组显著降低了轻-中异常增生的病灶数目（P ＜0.05）。从结果上可以看出，增生平水相提取物对单纯增生及轻-中度异常增生的作用较明显，也就是癌症发生的早期阶段，这也正是化学预防药物作用的适宜阶段。

在化学致癌的过程中，细胞增殖被认为可以促进肿瘤发生的启动阶段，并且在肿瘤的促进因子和非基因毒性的致癌物中发挥了重要作用[14]。由于不同部位的癌前损害是以细胞过度增殖为特征的，并且随着异常增生的程度而加重，因此，细胞增殖标记物有助于评价口腔癌前病变的程度和类型以及组织癌变的情况[15]。BrdU 是一种人工合成的核酸前体，是胸腺嘧啶类似物，可以被处于S期的细胞亚群经由核酸旁路摄取，代替胸腺嘧啶整合入新合成的DNA 单链之中，因而检测BrdU的阳性细胞率能反映组织细胞的增殖情况。由于BrdU 特异性的反映S 期细胞的活跃程度，因而对评价组织细胞的癌变潜力及预后也有重要的参考意义[16]。本项研究中通过对地鼠颊囊标本中BrdU的阳性细胞率的测定，发现随着组织病损恶性程度的增加，BrdU 的阳性细胞率明显增加，这就代表细胞增殖在相应增加，提示细胞的异常增殖与口腔癌的发生发展密切相关。

2004 年美国的一项体内研究实验提示增生平是一种有效的肺癌化学预防药物，可能是通过抑制细胞增殖、增加细胞凋亡或两者兼有达到预防效果[17]。本实验BrdU 增殖指数结果说明增生平提取物水相在癌症发生早期阶段发挥主要作用，可能也是通过遏制细胞的过度增殖，阻断肿瘤的发生。不同浓度之间的作用效果也不同，说明增生平提取物水相对细胞增殖的抑制作用有一定的剂量依赖性。

肿瘤的发展是由于细胞的增殖和凋亡之间的平衡被打破。2012 年美国的一项研究发现ZSP 在体外抑制脑肿瘤生长，部分原因是通过诱导细胞凋亡完成[18]。Bcl-2 不仅是癌基因，也是重要的细胞凋亡调节剂，它可以保护细胞拮抗凋亡。Bcl-2的升高可以使肿瘤细胞绕过生理性凋亡的正常调控机制，并且使这些细胞更进一步地产生基因的改变，如c-myc 的扩增、p53 的突变或激活其它的癌基因，从而使肿瘤的侵犯性进一步增加[19-20]。

本次实验利用western blotting 检测Bcl-2 蛋白的表达，结果显示增生平提取物水相中、高剂量组明显的抑制了Bcl-2 蛋白的表达，Bcl-2 蛋白表达的下调可以促进细胞凋亡，从而抑制口腔癌的发生和发展。在低剂量组中，Bcl-2 蛋白表达也有所下降，且与中剂量组极为接近，说明增生平提取物水相可以抑制Bcl-2 蛋白的表达，从而促进癌细胞的凋亡，并且呈剂量依赖性，剂量越高，效果越明显。

本实验创新了增生平在实验性口腔癌中应用方法，证实局部应用增生平水相提取物对口腔癌有一定的化学预防作用，但也存在很多局限性，因为在实验中我们更多的关注于癌变组织发生的病理变化，那么癌旁正常组织细胞的增殖和凋亡是否会因为药物的影响而发生改变呢，就需要我们进一步的研究。同时本实验基于前期动物实验结果，在增生平水相提取物原始浓度（1.4g /100ml）的基础上直接按二分法下调药物浓度设置分组，未进行有效浓度的梯度筛选也是本实验的一个很大的不足，在后续实验中，应增加浓度筛选过程，细化实验分组，最终筛选出最佳有效浓度。

4 结 论

局部应用增生平水相提取物能够通过抑制细胞增殖以及促进细胞凋亡来发挥肿瘤的化学预防作用，在口腔癌促癌及进展阶段时这种化学预防效果最为显著且呈一定的剂量依赖性。