真皮巨噬细胞通过SNX25/Nrf2 通路调控组织中的NGF 而调节痛敏

一、研究背景

肌体皮肤常受到机械创伤，其感觉由外周感觉神经元编码，这些神经元可分为感受非伤害性触觉刺激的低阈值机械感受器和感受伤害性刺激的痛觉感受器。DRG 小直径神经元是痛觉神经元，而中和大直径神经元优先感受低阈值机械刺激。皮肤损伤通过激活伤害性感受器、损伤部位常驻或浸润的非神经细胞（包括巨噬细胞、肥大细胞和角质细胞）导致炎症介质释放。组织巨噬细胞可分为神经相关亚群和血管相关亚群。皮肤巨噬细胞亚群与外周神经密切相关，并在受损时促进后者再生。在神经病理性疼痛时，巨噬细胞通过组织血管紧张素2 或补体5a 促进痛觉。

神经生长因子NGF 是一种分泌型小蛋白，参与多种急、慢性疼痛。NGF 在包括巨噬细胞在内的免疫细胞中表达，通过多种机制作用于感觉神经元促进痛觉的传递。NGF 可增强感受伤害性离子通道的活性、基因表达和膜定位，而增高感觉神经元的兴奋性。人NGF突变导致遗传性感觉神经和自主神经V 型病变(HSAN-V)，其主要临床表现是痛感缺失。HSAN-V 小鼠模型也表现出感觉神经所支配区域的痛敏降低，但其机制是否通过NGF 调控仍有待明确。

该研究的作者偶然发现了一个缺乏痛敏的转基因鼠品系，通过正向遗传分析确认Snx25是一个痛觉调节基因。SNX 蛋白有参与膜转运、细胞信号传导和细胞器运动等功能。该研究表明，真皮巨噬细胞 (dMacs) 中SNX25 通过抑制泛素化介导的转录因子Nrf2 的降解、进而促进NGF 生成。dMacs 中的SNX25 通过NGF/TrkA 通路调控正常和病理状态下的急性疼痛。因此，皮肤巨噬细胞-神经元轴是在正常、神经病理性或炎症等条件下，皮肤感受疼痛的重要一环。

二、研究结果

1.Snx25+/-鼠对痛不敏感

先天性白质脑病相关基因Mlc1转基因鼠(Mlc1Tg) 与WT 鼠（C57BL/6J 背景）比较，表现出对机械痛敏降低。由于Mlc1Tg鼠具有129S6、CBA 和C57BL/6J 混合遗传背景，所以Mlc1Tg鼠与C57BL/6J 鼠被回交七代后，再与C57BL/6J 背景的WT 鼠进行比较研究。正常状态下Mlc1Tg鼠表现出对vonFrey 纤毛检测的机械刺激阈值（VF 阈值）增高、对皮内注射5%福尔马林引起的急性炎性疼反应（福尔马林反应，如舔爪子、甩脚等反应）显著降低；在L4脊髓背角中也少见c-Fos+神经元。Mlc1Tg鼠是细菌人工染色体 (BAC) 转基因鼠，由于BAC 插入导致Snx25、Slc25a4和Cap97三个基因缺失。为研究Snx25对疼痛的调控功能，构建了Snx25全敲鼠。Snx25+/-雄鼠的VF 阈值比WT 高，与Mlc1Tg鼠相似；Snx25+/-鼠对福尔马林反应也比WT 低。尽管2月龄的Snx25+/-鼠的热伤害感受正常，但6～8 月龄的Snx25+/-鼠对热刺激的反应潜伏期比WT 长。

Snx25+/-鼠在SNI 模型时的机械痛敏比WT 明显减弱。3 周龄和成年Snx25+/-鼠的DRG 中大、小直接感觉神经元的数量、分布与同龄的WT 相近，表明痛觉异常不是因为神经元亚群丢失所造成的；2 月龄Snx25+/-鼠后足皮肤中PGP9.5+纤维面积与2月龄WT 相当，表明SNX25 缺失不影响外周感觉纤维的出芽/分枝等发育过程。

检测疼痛相关分子标志物的表达时发现，TRPV1 和TrkA 在Snx25+/-鼠DRG、坐骨神经和脊髓中的表达比WT 鼠显著降低。原代培养的Snx25+/-鼠DRG 神经元，辣椒素诱导的Ca2+水平比WT 幅度小；Snx25+/-鼠DRG 中TRPV1、Scn9a（编码NaV1.7）和Scn10a（编码NaV1.8）的mRNA 表达比WT 低。表明Snx25+/-鼠的疼痛不敏感表型与其外周感觉神经元中疼痛相关因子的表达减少有关。

2.特异性敲除DRG 神经元内Snx25 对疼痛仍敏感

Snx25fl/fl鼠与Advilin(Avil)CreERT2鼠杂交，并口服0.05%他莫昔芬 (TAM) 2 周以诱导基因重组，条件性敲除DRG 神经元中的Snx25（Snx25Avil-cKO鼠）。在给予TAM 后第3 周，Snx25Avil-cKO鼠DRG 中SNX25 的表达显著比Snx25fl/fl鼠低；但Snx25Avil-cKO鼠的VF 阈值和福尔马林反应正常，TRPV1、Scn9a和Scn10a的mRNA 表达也正常。表明DRG 神经元中SNX25 不参与疼痛相关因子的表达和痛觉的调控。

3.骨髓源性巨噬细胞 (BMDMs) 的SNX25 调控痛觉

免疫组化研究显示，Snx25+/-鼠后足皮肤中MHC-II+CD206+F4/80+巨噬细胞的数量以及CD206的表达与WT 相似。透射电镜观察发现，Snx25+/-鼠BMDMs 的总体形态与WT 鼠比较没有显著差异。为了进一步明确dMacs 对痛觉的贡献，用WT 或Snx25+/-鼠的巨噬细胞相互移植制作巨噬细胞嵌合体鼠，在移植后28 天，发现接受Snx25+/-骨髓移植的WT 鼠的VF 阈值增高，而接受WT 骨髓巨噬细胞的Snx25+/−鼠的VF 阈值降低。

免疫组化分析发现，Snx25+/-鼠在注射福尔马林后3 天，Iba1+CD206+标记的dMacs 比WT 鼠更少、趋化因子表达更低；在SNX25+/-鼠后足皮肤中的TGF-β 受体1 (TGF-βR1) 表达上调，该受体有抑制免疫反应的作用，并可被SNX25 所降解；在注射后7 天，Snx25+/-鼠后足皮肤和DRG 中CCR2+免疫细胞浸润程度低于WT，但差异无统计学意义。以上研究表明，SNX25 在BMDMs 的dMacs 中缺失，影响了正常和炎症条件下的痛觉感受。

4.巨噬细胞特异性Snx 25cKO 鼠对痛觉不敏感

Snx25fl/fl鼠与Cx3cr1CreERT2/WT鼠杂交，培育出条件性敲除单核细胞和巨噬细胞中SNX25鼠(Snx25Cx3cr1-cKO)。与Snx25fl/fl鼠比较，Snx25Cx3cr1-cKO鼠VF 阈值升高、福尔马林反应减少；DRG 中Scn9a和Scn10a表达也减少，而DRG 神经元的大小与分布都正常；后足皮肤中Cxcl5、Cxcl2、Il1b和Cxcl3的mRNA 表达降低；皮 肤CD45+CD11b+F4/80+细 胞 中Ccl2、Ccl3、Ccl4和Cxcl2的mRNA 表达也降低，而CD11b+F4/80+细胞的比例没有变化。表明dMacs 的SNX25 对化学刺激后的炎性痛以及正常状态下的痛觉有贡献。

为确定SNX25+dMacs 与外周神经之间的关系，该研究将Snx25Cx3cr1-cKO鼠与Ai39Tg/+鼠杂交培育Snx25CX3cr1-Cko/Ai39Tg/+鼠，TAM 诱导黄色荧光蛋白(YFP) 在CX3CR1+MHC-II+标记的dMacs 表达，而在CD117+肥大细胞中不表达。Snx25Cx3cr1-Cko/Ai39Tg/+鼠的真皮中，YFP+CX3CR1+标记的dMacs 与PGP9.5+纤维相靠近，表明SNX25+dMacs 与外周感觉纤维密切相关；而免疫组化研究发现WT 鼠皮肤中的F4/80+细胞和CD206+细胞与PGP9.5+神经末梢明显共定位。

将Snx25Cx30cr1-cKO鼠骨髓移植到Snx25fl/fl鼠，制备骨髓巨噬细胞嵌合体，TAM 口服2 周进行诱导，测试Snx25Cx3cr1-cKO鼠小胶质细胞对疼痛不敏感是否有贡献。TAM 诱导BMT 组的VF 阈值比BMT 前以及未诱前显著升高；SNI 模型中，诱导组机械性痛敏较未诱导组减弱。表明在正常和神经病理状态下，调控痛敏的是dMacs 中的SNX25，而非小胶质细胞中的SNX25。

5.SNX25 通过NGF 信号调控痛敏

Snx25+/−鼠在正常状态和福尔马林注射30 min后，后足皮肤中表达NGF 比WT 低；NGF 在WT 鼠MHC-II+F4/80+Iba1+标记的dMacs 中原位表达，在Snx25+/-BMDMs 中的表达减少。免疫组化研究发现，Snx25+/-鼠的TrkA 在坐骨神经结扎8 h 后的神经结扎远端的积聚比WT 显著减少，表明Snx25+/−DRG 中NGF/TrkA 复合物的逆行转运减少。Snx25Cx3cr1-cKO鼠与Ai32Tg/+鼠杂交培育Snx25Cx30cr1-cKO/Ai32Tg/+鼠，通过YFP 来追踪Snx25-KO 巨噬细胞，以检测SNX25对调节巨噬细胞来源NGF 表达的作用。通过观察诱导Snx25Cx3cr1-Cko/Ai32Tg/+鼠的BMDMs 表达YFP，发现YFP+BMDMs 中Ngf的mRNA 表达比YFP−BMDMs中的明显减少，表明SNX25调控Ngf的mRNA表达。接受Snx25Cx3cr1-Cko/Ai32Tg/+鼠骨髓移植的WT 鼠，经诱导后有44% MHC-II+dMacs 检测到有Ai32Tg/+来源的YFP 表达。免疫印迹研究显示，Snx25Cx3cr1-cKO鼠后足皮肤中NGF 表达比Snx25fl/fl鼠更低。

为研究dMacs 中Ngf的mRNA 表达，在WT鼠后背皮肤分选Lin−CD11b+CD64+Ly6C−MHC-II+标记 的dMacs、Lin−CD11b+CD64−Ly6C+MHC-IIlo标 记的真皮单核细胞 (dMonos) 和Lin−CD11b+CD64−Ly6C−MHC-II+标记的真皮树突细胞 (dDCs)。RT-qPCR 研究显示，WT 鼠Snx25的mRNA 表达在dDCs 中低于dMacs 和dMonos，但dMacs 和dMonos 之间无 显著性 差 异。Snx25+/−或Snx25Cx3cr1-cKO鼠dMacs中Ngf的mRNA 表达比WT 的dMacs 低；通过移植整个Snx-25Cx3cr1-Cko/Ai32Tg/+鼠的骨髓巨噬细胞到WT 鼠制备骨髓巨噬细胞嵌合体，在诱导后从受体鼠皮肤中分选MHC-II+YFP−标记的dMacs 中的Ngf 的mRNA 表达，比供体来源的MHC-II+YFP+标记的dMacs 要低；Snx25+/-鼠在皮内注射NGF 24 h 后，检测到VF 阈值恢复正常，而注射PBS 则没有恢复。以上研究表明，dMacs中的SNX25通过调节NGF表达进而调控痛敏。

6.SNX25 通过Nrf2 调节Ngf 的mRNA 表达

特异性siRNA 敲减BMDMs 中的Nrf2后可显著降低Ngf的mRNA 表达。细胞Nrf2 的表达受泛素化和蛋白酶体降解的调控，该调控可被Keap1 蛋白阻断。293T 细胞在蛋白酶体抑制剂MG132 处理后，多聚泛素化的Nrf2 蛋白增加，并在siRNA 敲减Snx25后进一步升高；相反，与仅过表达Nrf2相比，293T 细胞在瞬时转染过表达SNX25 和Nrf2 后，多聚泛素化的Nrf2 则降低。293T 细胞过表达鼠源的Snx25和Nrf2后，SNX25 与Nrf2 可免疫共沉淀；体外泛素化检测发现，敲减Snx25的BMDMs 中泛素化Nrf2蛋白的表达比对照有所增加。Snx25+/-鼠后足皮肤中受Nrf2 调控的血红素加氧酶1 比WT 有所减少，通过siRNA 敲减加速Nrf2 降解的Keap1，可以恢复Snx25+/−BMDMs中的Ngf表达。以上研究表明，SNX25 通过调控Nrf2 泛素化进而调控Ngf的mRNA 表达。

7.SNX25 是dMacs 的关键痛觉调控因子

该研究在小鼠后足皮内连续2 次注射Clodronate liposome 消除小鼠体内的dMacs，用免疫组化分析发现，在第2 次注射后3 天，Clodronate liposome处理鼠皮内CD206+或MHC-II+巨噬细胞比脂质体对照显著减少，但VF 阈值增高；免疫印迹分析显示，Clodronate liposome 处理鼠皮内NGF、SNX25和CD206 的表达低于脂质体对照组。表明在正常状态下dMacs 是痛觉所必需的。

DRG 中的巨噬细胞可参与神经病理性疼痛的调控。免疫组化共标显示，WT 和Snx25+/-鼠DRG 的MHC-II+巨噬细胞与PGP9.5+神经相接近，CD206+或F4/80+巨噬细胞低中度表达Snx25。GFP+鼠的全骨髓巨噬细胞静脉移植到WT 鼠后5 周检测发现，约60%的MHC-II+DRG 巨噬细胞表达GFP，而坐骨神经中的GFP+MHC-II+巨噬细胞很少，表明DRG 中发生了巨噬细胞的稳态转换。为检测DRG 巨噬细胞对疼痛过敏的影响，研究者手术暴露Snx25Cx3cr1-Cko/Ai32Tg/+、Snx25fl/fl和Ai32Tg/+鼠的L4～5DRGs，注射4-OHT诱发条件性敲除DRG 内的Snx25；在注射后第5 天用免疫组化检测发现，Snx25Cx3cr1-Cko/Ai32Tg/+鼠DRG中检测到Ai32Tg/+来源的YFP+巨噬细胞，Snx25fl/fl/Ai32Tg/+鼠则没有；Snx25Cx3cr1-Cko/Ai32Tg/+鼠DRG 中91% YFP+细胞是SNX25−，表明局部给予4-OHT诱导基因重组并成功条件性敲除SNX25。SNX25免疫荧光定量分析显示，在注射4-OHT 后5 天，Snx25Cx3cr1-Cko/Ai32Tg/+鼠DRG 内CD206+巨 噬 细 胞仅14%是SNX25+（与Snx25fl/fl/Ai32Tg/+鼠比较），证实4-OHT 处理基本消除了DRG 巨噬细胞中的SNX25。注射4-OHT 后5 天，Snx25Cx3cr1-Cko/Ai32Tg/+鼠同侧后足VF 阈值与对侧接近、同侧后足VF 阈值与注射前接近、且与Snx25fl/fl/Ai32Tg/+鼠VF 阈值接近，表明DRG 巨噬细胞中的SNX25 在正常条件下不参与痛觉调控。在正常状态下，F4/80+DRG巨噬细胞表达NGF 较低，表明DRG 巨噬细胞对NGF 表达及疼痛传导的调节机制不同于dMacs，即dMacs 的SNX25 而非DRG 巨噬细胞内的SNX25在正常状态下调节急性疼痛。

三、讨论

综上所述，该研究发现Snx25+/-鼠和Snx25Cx3cr1-cKO鼠在正常和诱导疼痛条件下都可以降低痛反应。SNX25 通过抑制Nrf2 的泛素化和蛋白酶降解，以调节Ngf的mRNA 转录，并进一步维持dMacs 中Ngf 的生成。SNX25 的缺失加速了Nrf2 的降解而降低NGF 表达，从而导致对疼痛不敏感。

已证实HSAN-V病人的主要临床表现是痛觉丧失，是由NGF 基因突变导致的。该研究在Snx25Cx3cr1-cKO鼠中减少NGF 表达在一定程度上模拟了HSAN-V 的病理，但该研究没有继续观察NGF 缺失的长期效应如神经末梢退化和收缩等形态学改变。NGF 的中和单克隆抗体已在研发过程中，可能作为缓解顽固性疼痛的治疗手段。尽管关节痛和骨坏死等意想不到的不良反应阻碍了这些单克隆抗体进入临床，但NGF 仍然是研发镇痛药物的良好靶标。dMacs 中SNX25/Nrf2 轴可能将HSAN-V 的无痛表型桥联到痛敏状态，可能成为代替抗NGF 单克隆抗体的非常有前景的药物靶标。但NGF 也可以由如角质细胞等非炎症细胞产生，因此需要进一步来研究调控外周NGF 的细胞和分子机制。