RRS1对乳腺癌细胞增殖和迁移的影响及其作用机制

吴清兰 邓林 孙文静 张丽 张金平 侯琳

(1 青岛大学基础医学院生物化学与分子生物学系,山东 青岛 266071; 2 青岛大学药学院;3 中国人民解放军海军第971医院泌尿外科)

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一,其发病率和死亡率正在逐年上升,严重威胁着女性的生命健康［1］。尽管在诊断和治疗方面取得了进步,但是乳腺癌患者的复发率和死亡率仍然很高［2］。因此,需要更全面地了解乳腺癌发生和进展的潜在机制,以确定乳腺癌特异性的生物标志物以及治疗靶点,改善乳腺癌的治疗效果。核糖体合成调控因子1(RRS1)最早在酵母中被发现,由203个氨基酸组成,也是真核生物的保守蛋白［3］。RRS1在核糖体生物发生中扮演重要的角色,此外,RRS1还与细胞有丝分裂、端粒聚集以及染色体重排密切相关［3］。RRS1基因的异常表达会导致核糖体功能障碍,进一步影响蛋白质的合成。近几年,多项研究表明RRS1在肝细胞癌［4］、结直肠癌［5］、宫颈癌［6］以及胃癌［7］等多种恶性肿瘤中过表达,提示其可能作为癌基因促进肿瘤生长和转移。本课题组前期研究发现RRS1在乳腺癌中高表达,RRS1可以通过RPL11/MDM2/p53信号传导促进乳腺癌细胞的增殖［8-9］。另外有研究结果显示,RRS1基因可以通过RPL11/c-Myc/SNAIL轴调节人类乳腺癌细胞的侵袭和转移［10］。由此可见,RRS1与乳腺癌的发生及进展密切相关,但RRS1在乳腺癌中的作用及其机制尚不明确,相关方面的报道也甚少。本研究通过观察敲降RRS1基因对乳腺癌BT549细胞增殖和迁移的影响,探讨RRS1在乳腺癌发生和进展中的潜在机制,以期能够为乳腺癌的诊断和治疗提供新的靶点。

1 材料与方法

1.1 实验材料

细胞系MDA-MB-231、MCF-10A、MDA-MB-468、BT-549和MCF-7均购自中国科学院(昆明)细胞库。CCK8试剂盒、BCA蛋白浓度测定试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司,RRS1、AKT、mTOR、p-AKT、p-mTOR抗体购买于英国Abcam公司,缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)以及GAPDH、血管内皮生长因子(VEGF)抗体均购自武汉爱博泰克生物科技有限公司,Trizoll Reagent、RNA定量试剂盒购自南京诺唯赞生物科技有限公司,RRS1敲降慢病毒购自上海吉凯基因医学科技有限公司。

1.2 细胞培养

MDA-MB-231、MDA-MB-468、BT549、MCF-7和MCF-10A细胞置于含体积分数0.10的胎牛血清和青链霉素混合溶液(100 mg/L链霉素、100 mg/L青霉素)的DMEM培养基中,在37 ℃、含体积分数0.05 CO2条件下进行培养,根据细胞生长状态换液传代,培养两代后,可进行细胞冻存及后续实验。

1.3 免疫荧光检测RRS1在BT549细胞中的定位

取生长状态良好的BT549细胞,接种于铺有细胞爬片的24孔板中,待细胞贴壁且形态完全舒展时,以40 g/L甲醛固定20 min,继而以2 g/L的Triton X-100透化10 min,然后加入200 μL即用型山羊血清,室温孵育30 min,PBST洗涤细胞3次。然后将细胞与RRS1(1∶200稀释)一抗在4 ℃下孵育过夜,第2天,加入相应种属的荧光二抗,室温孵育1 h,PBST洗涤细胞3次,后置于暗室室温下用DAPI染色5 min,PBST洗涤3次,将爬片取出,用封片剂固定在载玻片上,在共聚焦显微镜下拍照。

1.4 慢病毒感染BT549细胞

取生长状态良好的BT549细胞,接种到6孔板(约1.5×105个细胞/孔),当细胞汇合度达30%时,分别感染阴性对照慢病毒(Con组)以及shRNA-RRS1慢病毒(sh-RRS1组),根据细胞的病毒感染复数值计算需要加入的病毒体积,将适量的病毒以及转染试剂与1 mL的无血清DMEM培养基混匀,加入6孔板中,感染8～16 h后,更换为完全培养基继续培养。感染72 h以后,于倒置荧光显微镜下观察细胞荧光强度,当荧光强度达70%以上时进行后续实验。

1.5 Western Blot实验检测细胞中RRS1蛋白表达量

当稳定生长的MDA-MB-468、MCF-7、BT-549、MDA-MB-231、MCF-10A细胞及慢病毒感染的两组BT549细胞融合度达到80%～90%,吸弃原培养基,用PBS冲洗2次。加入含有10 g/L蛋白酶抑制剂和10 g/L磷酸酶抑制剂的RIPA缓冲液,在冰浴中裂解细胞30 min,收集细胞裂解液,用BCA法检测蛋白浓度。将裂解得到的蛋白样品加入适量的蛋白上样缓冲液进行蛋白变性,根据蛋白浓度计算上样体积。用含体积分数0.10的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离,恒压80 V直至各孔样本穿过浓缩胶,然后调整为恒压120 V继续电泳。直至指示剂迁移至凝胶底部,然后300 mA恒流下将蛋白转移到PVDF膜上。用50 g/L脱脂奶粉封闭2 h,并在4 ℃下与一抗孵育过夜。用TBST洗膜3次,每次10 min,然后放置摇床上常温孵育二抗1 h,TBST洗膜3次,每次10 min。加入ELC显色液显影拍照。以GAPDH为内参,使用Image J软件计算目的蛋白相对表达量。

1.6 RT-qPCR检测细胞中RRS1 mRNA的表达

使用Trizol试剂提取稳定感染的Con组和sh-RRS1组细胞总RNA,检测并调整浓度,确保两组浓度一致,每次反应使用1 μg总RNA,通过反转录合成第一链cDNA,按照试剂说明书要求进行RT-qPCR,以GAPDH基因为内参,以2-△△CT法计算RRS1 mRNA的相对表达量。引物序列见表1。

表1 RT-qPCR引物名称及其序列

1.7 CCK8实验检测细胞的增殖能力

将Con组和sh-RRS1组细胞,接种到96孔板(约2×103个细胞/孔)。分别于接种后第1、2、3、4、5天的10:00,将10 μL CCK8试剂与90 μL培养基混合,加入到有细胞的每个孔中,继续孵育2 h,并使用酶标仪在波长450 nm处检测各组细胞的吸光度值。

1.8 集落形成实验检测细胞的增殖能力

将Con组和sh-RRS1组细胞,分别接种于6孔板(约1×103个细胞/孔),每2～3 d根据细胞状态进行换液培养。培养14 d或每个克隆均包含50个细胞以上时,菌落用40 g/L甲醛固定,PBS冲洗2次,然后向每个孔中加入5 g/L的结晶紫500 μL染色30 min。用PBS洗净后自然晾干,拍照并进行计数分析。

1.9 细胞划痕实验检测细胞的迁移能力

将Con组和sh-RRS1组细胞,分别接种于6孔板中(约2×105个细胞/孔),待细胞融合度达90%以上且细胞为单层状态后,使用200 μL移液器吸头稍微刮擦单层, 形成均匀的无细胞伤口区域,向每孔中加入2 mL无血清培养基,分别在培养第0、12、24 小时时用倒置显微镜拍照,计算第24小时时细胞迁移情况。

1.10 Transwell实验检测细胞的侵袭能力

将Con组和sh-RRS1组细胞以每孔约2×105个细胞接种至小室中,加入含30 μL基质凝胶(1∶8稀释)的无血清培养基,并且确保小室的终体积为200 μL,下室加入600 μL含体积分数0.15血清的培养基,培养24～48 h后,用棉签擦去小室内的细胞,并将底部的侵袭细胞固定染色,用PBS清洗后自然晾干,在光学显微镜下成像并计数。

1.11 Western Blot 实验检测细胞中AKT-mTOR相关信号通路蛋白的表达量

当Con组和sh-RRS1组培养的细胞融合度达到80%～90%时,吸弃原培养基,用PBS冲洗2次,用RIPA缓冲液裂解两组细胞的总蛋白,BCA法检测蛋白浓度。采用Western Blot方法检测两组细胞中AKT、m-TOR、p-AKT、p-mTOR、VEGF以及HIF-1α蛋白的相对表达量,实验步骤同1.5。以GAPDH为内参蛋白计算目的蛋白的相对表达量。

1.12 统计学处理

2 结 果

2.1 乳腺癌细胞系中RRS1表达量比较

Western Blot实验的结果显示,正常MCF-10A与乳腺癌细胞系MDA-MB-468、MCF-7、MDA-MB-231、BT549细胞中的RRS1蛋白相对表达量分别为0.27±0.07、0.79±0.03、1.22±0.06、1.05±0.06、1.28±0.10。各组间比较差异有显著性(F=48.92,P<0.05),其中4种乳腺癌细胞系中RRS1表达量显著高于MCF-10A细胞系(P<0.05),4种乳腺癌细胞系之间比较差异无显著性(P>0.05)。

2.2 RRS1在BT549细胞中的定位

免疫荧光染色显示,RRS1主要在BT549细胞的细胞核和核仁表达,细胞质也有少量表达。见图1。图中绿色荧光染色的为RRS1。

图1 RRS1在BT549细胞中的定位(免疫荧光染色,400倍)

2.3 慢病毒感染BT549细胞后RRS1表达量比较

Con组细胞中RRS1 mRNA和蛋白的相对表达量分别为1.01±0.01、0.91±0.04,sh-RRS1组分别为0.27±0.04、0.51±0.02。两组细胞中RRS1 mRNA和蛋白表达量比较差异均具有显著性(t=32.04、15.09,P<0.05)。证明RRS1敲降成功。

2.4 RRS1对BT549细胞增殖能力的影响

实验结果显示,时间、组别以及时间组别交互作用对细胞增殖能力均具有显著影响(F时间=497.30,F组别=3 341.00,F交互=66.87,P<0.05)。单独效应分析显示,两组细胞不同时间点细胞增殖能力比较差异具有显著性(F=458.40、323.00,P<0.05),其中,与第1天相比,Con组和sh-RRS1组细胞其他时间点细胞增殖能力均明显增强(P<0.05);与Con组相比,sh-RRS1组细胞在第4、5天的增殖能力明显减弱(F=1 368.00、2 699.00,P<0.05),见表2。集落形成实验结果显示,Con组和sh-RRS1组集落形成数目分别为60.00±3.00、29.00±3.00,两组相比较差异均具有统计学意义(t=14.86,P<0.05)。

表2 两组细胞的细胞增殖能力比较

2.5 RRS1对BT549细胞迁移和侵袭能力的影响

细胞划痕实验结果显示,Con组和sh-RRS1组细胞从0 h至24 h的迁移率分别为0.48±0.05、0.19±0.02,两组细胞的迁移能力比较差异具有显著性(t=9.06,P<0.05)。Transwell实验结果显示,Con组和sh-RRS1组细胞迁移通过小室的数目分别为103.33±7.09、29.67±7.63,两组细胞迁移通过小室的数目比较差异具有显著性(t=12.24,P<0.05)。见图2。

A:Con组,B:sh-RRS1组;结晶紫染色,200倍

2.6 RRS1对侵袭和迁移相关蛋白表达的影响

Western Blot实验结果显示,与Con组相比,sh-RRS1组细胞中AKT、mTOR蛋白相对表达量比较差异无显著性(P>0.05),p-AKT、p-mTOR、VEGF、HIF-1α蛋白相对表达量比较差异均有显著性(t=6.29～22.86,P<0.05)。见表3。

表3 两组细胞中AKT-m-TOR通路相关蛋白的表达量比较

3 讨 论

近年来,中国乳腺癌新发病例数呈不断升高趋势［11］,每年有超过16.9万女性患有乳腺癌［12］。尽管在治疗干预方面取得了一定进展,但大约有30%的早期乳腺癌患者会发生转移,5年相对生存率约为25%［13］。乳腺癌转移过程极其复杂,其发病机制尚未阐明。因此,更全面地了解乳腺癌发生和进展的潜在机制,寻找更有效的新的治疗靶点,对提高乳腺癌患者的生存率非常重要［14］。

RRS1是核糖体生物发生的调节因子［3］。人类RRS1基因位于染色体8q13.1上,仅包含一个外显子［3］。RRS1在核糖体生物合成、赤道板染色体聚集和细胞周期端粒聚集中起重要作用［15-16］。RRS1通过促进内质网应激在亨廷顿病的发病机制中起重要作用［17-18］。近几年,RRS1基因在肿瘤中的作用逐渐受到关注。GAMBE等［15］发现RRS1蛋白有助于HeLa细胞的染色体聚集。WU等［5］发现,在结直肠癌细胞中,敲降RRS1基因通过阻滞G2/M期进展和血管生成,进而抑制结直肠癌细胞增殖和肿瘤发生。MA等［7］的研究发现在胃癌细胞中敲降RRS1基因可诱导凋亡并可抑制细胞增殖、迁移和侵袭。YAN等［19］发现在视网膜母细胞瘤细胞中,敲降RRS1基因可通过AKT/mTOR信号通路促进细胞的增殖和侵袭。由此可以推测,RRS1基因与肿瘤的发生发展密切相关。本课题组前期利用TCGA数据库结合高内涵筛选技术筛选出与乳腺癌细胞增殖和侵袭转移有关的RRS1基因,并首次报道了RRS1在乳腺癌细胞增殖中的作用［8-9］。但目前关于RRS1基因与乳腺癌相关研究仍较少。

为了探索RRS1在乳腺癌细胞中的潜在作用,本研究首先使用Western Blot实验分析比较RRS1在MDA-MB-231、MDA-MB-468、BT549、MCF-7乳腺癌细胞系和正常乳腺上皮MCF-10A细胞系中的表达量,结果显示这4种乳腺癌细胞系的RRS1蛋白表达量显著高于正常乳腺上皮细胞系MCF-10A。进一步选择RRS1高表达的BT549细胞以求明确RRS1在乳腺癌细胞中的表达位置。免疫荧光染色显示,RRS1主要在BT549细胞的细胞核和核仁表达,细胞质也有少量表达。为进一步探讨RRS1基因在乳腺癌细胞中作用机制,本研究使用shRNA-RRS1慢病毒感染了BT549细胞,RT-qPCR以及Western Blot实验检测慢病毒对RRS1基因的敲降效果,结果显示敲降RRS1基因显著降低了BT549细胞RRS1 mRNA和蛋白的表达量。进一步研究显示,敲降RRS1抑制了BT549细胞的增殖、迁移和侵袭能力。这些结果均提示RRS1在乳腺癌细胞的发生发展中起到了重要作用。

AKT/mTOR通路是一种经典的信号通路,对细胞增殖、代谢和运动等调控至关重要［20］。AKT/mTOR通路在多种癌症中处于异常的高激活状态,且与临床的不良预后有关,在肿瘤细胞转移、血管新生等方面发挥有关键作用［21-22］,同时其异常激活还会促进乳腺癌细胞的转移和糖酵解,干预该通路的激活对于乳腺癌治疗提供了新的思路［23］。因此,本研究进一步分析了RRS1对该通路的调控作用,敲降RRS1基因不影响AKT、mTOR的总蛋白水平,但可以明显抑制BT549细胞AKT、mTOR蛋白的磷酸化水平,提示RRS1基因很可能直接或间接激活AKT/mTOR相关信号通路。血管生成对于恶性肿瘤的生长、转移以及预后均具有极其重要的意义［24］。HIF-1α是调节血管生成的重要因子,能够促进VEGF的表达［25］。由于Akt/mTOR通路是一种调节HIF-1α、VEGF蛋白表达的经典通路,所以进一步探讨RRS1是否通过调控AKT/mTOR通路影响下游HIF-1α、VEGF蛋白的表达。本研究发现敲降RRS1基因通过抑制AKT/mTOR的激活,抑制了下游HIF-1α、VEGF蛋白的表达,进而抑制了BT549细胞的增殖和迁移。

综上所述,RRS1在乳腺癌细胞中高表达,在细胞核和胞浆都有定位,敲降RRS1通过抑制AKT/mTOR信号通路及其下游蛋白的表达,进而抑制乳腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力。因此,RRS1可能是乳腺癌潜在的治疗靶点。然而,该研究仅限于细胞水平,后续还需要对相关机制进行更深入和更全面的探讨。

作者声明：吴清兰、邓林、张金平、侯琳、孙文静和张丽参与了研究设计;吴清兰、侯琳和张金平参与了论文的写作及修改。所有作者均阅读并同意发表该论文,且均声明不存在利益冲突。