siRNA干扰波形蛋白对肝门部胆管癌裸鼠移植瘤生长的研究

宋双龙,王 石

(1.河南中医药大学第三附属医院 普外科,河南 郑州450003; 2.内蒙古自治区人民医院 肝胆胰脾外科,内蒙古 呼和浩特010110)

肝门部胆管癌(Hilarcholangiocarcinoma,HCCA)有较高的发病率,具有位置比较特殊、起病隐匿、结构复杂等特点,HCCA的诊断和治疗一直是外科学的难题之一[1]。由于症状的迟发和缺乏有效的治疗,疾病诊断后的平均存活率仍低于1年[2]。波形蛋白(Vimentin,VIM)是广泛表达于细胞和组织中的一种Ⅲ型中间丝纤维蛋白[3]。VIM作为一种细胞骨架和上皮-间充质转化(EMT)的一种关键标志物,与细胞的运动、迁移以及侵袭能力密切相关,并且会诱导癌细胞EMT的过程和转移[4-5]。本文探讨VIM在HCCA病情进展中的意义。

1 材料与方法

1.1 细胞

肝门部胆管癌QBC939细胞由课题组前期购买,于内蒙古自治区人民医院科研中心保存。

1.2 试剂

BI公司的胎牛血清及细胞培养基;吉玛基因设计并合成的siRNA序列;生工生物公司合成设计的引物序列;全式金公司的逆转录试剂盒(Promega)以及实时荧光定量试剂盒等。

1.3 动物种系

SPF级BALB/c-Nude雌性裸鼠购于北京维通利华实验动物技术有限公司。

1.4 方法

1.4.1细胞转染 对QBC939细胞株进行细胞培养及传代,使用脂质体法将siRNA-VIM1、siRNA-VIM2、siRNA-VIM3以及siRNA-NC转染入QBC939细胞内,置于培养箱中培养24 h后,使用qRT-PCR法检测各组细胞中VIM的表达量。

1.4.2细胞克隆实验 将siRNA-VIM1、siRNA-VIM2、siRNA-VIM3以及siRNA-NC转染入QBC939细胞24 h后进行细胞计数,按每孔3000细胞加入6孔板培养,6天后显微镜下可见细胞菌落形成,弃去培养基用4%多聚甲醛固定30 min,结晶紫溶液染色30 min,PBS清洗后拍照保存。

1.4.3活细胞实时监测实验 将siRNA-VIM1、siRNA-VIM2、siRNA-VIM3以及siRNA-NC转染入QBC939细胞24 h后进行细胞计数,按每孔0.3×105细胞加入48孔板中,培养箱培养6 h后上机检测,每间隔40 min进行拍照记录。

1.4.4裸鼠成瘤实验 按照每只0.2 ml且细胞数目为2×106的QBC939细胞悬液接种于裸鼠背部皮下,用游标卡尺测量肿瘤最长径(L)和最短径(W),按照公式V(mm3)=0.52×L×W2计算瘤体积。待皮下移植瘤体积达到50 mm3时,将成瘤的裸鼠随机均分为3组给予药物干预,分别为Control组(每只注射0.2 ml的生理盐水)、siRNA-VIM组(每只注射0.2 ml的siRNA-VIM2)、siRNA-NC组(每只注射0.2 ml的siRNA-NC)。每天1次,每3天测量一次肿瘤体积大小。15 d后脱颈处死小鼠,剥取瘤体测量体积。

1.4.6HE染色实验 取各组瘤体依次进行石蜡切片;脱蜡、水化;蒸馏水冲洗;苏木素染色、流水冲洗;1%盐酸酒精分化、流水冲洗;氨水返蓝后流水冲洗;伊红染色;脱水透明;切片晾干后中性树胶封闭;显微镜下采集图像分析。

1.4.7免疫组织化学染色 对各组瘤体依次进行石蜡切片;脱蜡、水化;EDTA修复;双氧水孵育;BSA封闭;加一抗孵育过夜;加二抗孵育;DAB显色后苏木素复染;脱水透明后中性树胶封闭、显微镜下观察。免疫组化结果判读使用Image Pro plus测量平均IOD值进行分析。

1.4.8统计学分析 使用统计软件SPSS26.0分析实验数据,以“平均数±标准差”表示计量资料,两组之间比较采用t检验,多组之间比较采用方差分析,当P<0.05认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 qRT-PCR检测siRNA干扰QBC939细胞VIM的mRNA表达情况

将不同组的siRNA-VIM转染入QBC939细胞48 h后,检测各组细胞VIM的mRNA表达情况。三组不同的siRNA-VIM转染细胞后,其VIM的表达量均低于siRNA-NC组(P<0.05)。且在三组实验组中,siRNA-VIM2转染后抑制VIM表达效果更好,见图1。

图1 不同转染组VIM的mRNA表达情况

2.2 克隆形成实验观察siRNA-VIM对QBC939细胞克隆形成能力的影响

采用平板克隆形成实验检测抑制VIM表达后对QBC939细胞克隆形成能力的影响。与对照组相比,三组核酸序列不同的siRNA去抑制VIM的表达后,均可以使QBC939细胞的克隆形成数呈现出显著减少的趋势(P<0.05),见图2、图3。

图2 各组细胞克隆结果图

图3 各组细胞克隆数目结果图

2.3 活细胞实时监测实验评价siRNA-VIM对肝门部胆管癌QBC939细胞分裂能力的影响

使用三维低氧多通道成像仪在40倍镜明场下对QBC939细胞进行活细胞实时监测,从上机监测开始规定时间为0 h,每间隔40 min对细胞进行拍照,48 h后结束实验。每组取3个视野,计算每个视野中细胞核数目,取3个视野中细胞核数目的平均值。与siRNA-NC对照组相比,siRNA-VIM1、siRNA-VIM2以及siRNA-VIM3组的细胞分裂数目明显减少(P<0.05)。见图4～8,表1。

表1 各组细胞核数目

图4 各组QBC939细胞分裂0 h图

图5 各组QBC939细胞分裂12 h图

图6 各组QBC939细胞分裂24 h图

图8 各组QBC939细胞分裂48 h图

2.4 抑制VIM对肝门部胆管癌QBC939裸鼠移植瘤的生长抑制作用

在QBC939裸鼠移植瘤模型中抑制VIM表达后,观察移植瘤生长体积的变化。与对照组相比,siRNA-VIM组可以使肿瘤生长速度受到抑制,见图9～10,表2。

表2 各组肝门部胆管癌裸鼠皮下移植瘤体积

图9 肝门部胆管癌荷瘤裸鼠瘤体

图10 肝门部胆管癌荷瘤裸鼠体积箱式图

2.5 qRT-PCR检测裸鼠瘤组织中VIM的mRNA相对表达量

使用qRT-PCR检测各组裸鼠瘤组织中VIM的mRNA相对表达量,与对照组相比,裸鼠瘤组织内注射siRNA-VIM,其瘤体内VIM表达在mRNA水平上显著降低,见图11。

图11 各组瘤组织mRNA表达量

2.6 裸鼠瘤组织HE染色结果

Control组、siRNA-NC组可见肿瘤细胞排列紊乱,细胞大小不一,核大,核仁清晰,可见核分裂像,未见明显坏死及炎性细胞浸润。siRNA-VIM组可见肿瘤细胞减少,排列疏松,细胞核萎缩,核仁较不清晰,可见片状坏死,伴轻度炎性细胞浸润,见图12。

图12 各组瘤体HE染色(×20)

2.7 免疫组织化学检测裸鼠瘤组织中VIM的表达情况

每组瘤组织共切取3份样本包埋进行免疫组化检测,siRNA-VIM与Control组和siRNA-NC组相比VIM表达下降(P<0.05),siRNA-NC组与Control组相比VIM表达变化无显著差异(P>0.05),见图13及表3。

表3 免疫组化IOD值

图13 免疫组化检测各组瘤体中VIM表达情况(×20)

3 讨论

手术是HCCA最好的治疗选择,目标是根治边缘阴性(R0)肿瘤的切除。但切除HCCA的5年疾病特异性生存率约为40%,切除后复发很常见[6]。由于缺乏早期症状,很高比例的患者在出现时被诊断为晚期疾病(血管受累;肝内或肝外转移)[7],已经失去了手术的最佳时期,且由于其早期可能侵犯肝动脉和门静脉,手术切除非常困难。在现有的治疗方法中,HCCA的复发和转移率高,生存率低。VIM作为一种细胞骨架和EMT的一种关键标志物,与细胞的运动、迁移以及侵袭能力密切相关[8]。许多数据证实波形蛋白参与肿瘤细胞的侵袭,波形蛋白还与许多肿瘤的发生发展有密切的关系[9]。在体外,波形蛋白被证明是肿瘤相关成纤维细胞在集体侵袭期间运动所必需的,而波形蛋白的敲除抑制了肿瘤细胞的侵袭[10],而且可以恢复部分其上皮表型。研究表明上皮衍生肿瘤细胞中VIM表达的上调是EMT诱导的先决条件,也是EMT的主要引发剂[11]。

本研究首先通过构建可以抑制VIM表达的不同核苷酸序列的siRNA,成功将siRNA转染到肝门部胆管癌细胞株QBC939中,通过体外实验细胞克隆以及活细胞实时监测观察细胞分裂情况,对比转入阴性对照siRNA-NC和实验组siRNA-VIM得到抑制QBC939细胞VIM表达后,细胞的克隆能力以及分裂能力均呈现出降低的趋势。说明在体外细胞实验中,抑制VIM的表达后,对肝门部胆管癌细胞的克隆及分裂能力具有明显的抑制作用。

本实验通过构建肝门部胆管癌皮下移植瘤裸鼠模型,在造模成功后,分别对荷瘤裸鼠瘤体注射生理盐水、siRNA-VIM、siRNA-NC,2周后测量各组荷瘤裸鼠瘤体积大小,注射siRNA-VIM组瘤体积小于另外2组,生理盐水组与siRNA-NC组瘤体积无显著差异,说明抑制VIM表达后,裸鼠皮下移植瘤的生长速度减慢。通过qRT-PCR法检测各组肝门部胆管癌荷瘤裸鼠瘤体内的VIM表达,siRNA-VIM组瘤体积中VIM表达降低,差异有统计学意义,生理盐水组与siRNA-NC组中VIM表达无明显差异。同时对各组瘤体进行HE染色,siRNA-VIM组可见肿瘤细胞减少、排列疏松、细胞核萎缩、核仁较不清晰、可见片状坏死、伴轻度炎性细胞浸润,表明VIM可以促进肿瘤细胞的生长。用免疫组化验证各组瘤体中VIM表达,siRNA-VIM与生理盐水和siRNA-NC组相比VIM表达下降,差异有统计学意义。siRNA-NC组与生理盐水组相比VIM表达变化无显著差异。因此推断抑制VIM表达是抑制肝门部胆管癌进展的机制之一,VIM在肝门部胆管癌的进展中起一定作用。VIM作为EMT的重要标志物,与肿瘤的进展有密切联系,抑制VIM表达会影响EMT诱导的发生。