细菌整合子-基因盒系统表达调控的研究进展

汪小桐 戴碗琴

上海交通大学医学院附属松江医院（筹）检验科，上海 201600

细菌耐药问题已成为世界性难题，新型移动性基因元件-整合子的发现为人类研究细菌耐药带来了新的方向和挑战。整合子可通过位点特异性重组捕获耐药基因，使耐药基因在细菌中水平播散［1］。因整合子在细菌耐药机制中的重要作用，引起研究者的广泛关注。

细菌耐药现状

抗菌药物的不合理使用导致耐药菌层出不穷，“超级细菌”的出现更是给临床治疗带来巨大挑战。新型抗菌化合物及增效剂的研发是应对细菌耐药的主要手段，然而细菌突变和自由转换速度远远超过新药研发速度，细菌耐药形势严峻。2014 年英国政府委托相关人员进行研究显示，全球每年约70 万人的死亡是与细菌耐药性有关，如对现状不加以控制，预计2050 年因细菌耐药造成的经济损失将达100 万亿美元，死亡人数约1 000 万人［2］。美国疾病预防控制中心研究报告称，2019 年到2020 年新型冠状病毒大流行高峰之后，美国抗菌药物耐药性总体上升15%［3］。为遏制细菌耐药性的发生和发展，研究者们对引起细菌耐药的机制及播散原因进行了大量及深入研究［4-6］。20 世纪70 年代，人们大致确定了细菌耐药与可传播质粒有关，直到1989年Stokes和Hall［7］首次发现整合子，并通过研究认识到整合子几乎存在于所有环境中，是细菌获得抗生素抗性基因的主要机制［8］。

整合子的结构与功能

整合子是研究者在对耐药质粒和转座子进行相关研究时发现的一种移动性基因元件，其主要通过质粒和转座子进行转移［9］。整合子主要由5′保守区、3′保守区及中间的可变区组成。5′保守区主要包括编码整合酶的基因intI及其启动子Pint、重组位点attI和可变区的启动子Pc［10］，3′保守区因整合子种类的不同而有所差异，可变区由数量不等的基因盒组成。

整合子主要根据整合酶氨基酸序列的不同进行分类，目前，常见的整合子可分为4 类：第1 类整合子因其独特的进化优势，导致其在临床菌株中分布最广，与细菌耐药性关系最为密切［11］；第2 类整合子整合酶基因intI2 与intI1 有40%的同源性，但大部分第2类整合酶在编码第178个氨基酸后插入一个终止密码子TAA，不能翻译成完整的整合酶蛋白，为无功能性第2 类整合子，不具有整合与剪切耐药性基因盒的能力［12］；第3 类整合子目前在临床上较为少见，首次由Arakawa 等［13］于1995年在耐碳青霉烯类抗菌药物的黏质沙雷菌中的质粒上发现，2003 年在肺炎克雷伯菌中也分离出了第3 类整合子［14］；第4 类整合子可携带上百个基因盒，称为超级整合子。目前，有研究认为超级整合子是耐药整合子上基因盒的主要来源［15］。

整合子可通过位点特异性重组捕获与表达耐药性基因盒，使耐药基因水平转移，在细菌耐药性产生和播散中起到至关重要的作用。

基因盒的结构与表达

基因盒是一种大小为500～1 000 bp 的游离环状的可移动性基因元件，主要编码耐药基因，含有重组位点attC，该位点为整合酶识别位点。大部分基因盒不含有启动子，其主要利用整合酶基因上的Pc 启动子进行转录表达。整合子中基因盒通过不同的机制在转录和翻译水平上进行调节，是一个严格而复杂的过程。

1.Pc启动子在基因盒转录中的作用

基因盒一般以5′至3′的方向整合入整合子的attI位点，在上游整合子可变区启动子Pc 的作用下得以表达，少数整合子启动子Pc下游还存在启动子P2［16］。

目前，在第1类整合子中发现13种Pc启动子、4种P2启动子以及多种Pc+P2 启动子组合［17-18］。在临床和自然环境中最常见的Pc 启动子是强Pc 启动子（PcS）、弱Pc 启动子（PcW）、杂合Pc1 启动子（PcH1）和杂合Pc2 启动子（PcH2）。它们的分类基于相对转录强度，如PcH1 和PcS 在-35 区域的核苷酸序列分别为TGGACA 和TTGACA，二者仅有一个核苷酸不同，但转录强度差异有统计学意义，PcS 强度约为PcH1 的6 倍［18-19］。具有不同活性的Pc 启动子序列的多样性表明，细菌中耐药基因盒的表达因整合子中Pc 启动子的不同存在明显差异。

第2 类整合子attI2区域内存在4 个潜在的Pc2 启动子，分别为Pc2A、Pc2B、Pc2C 和Pc2D，分析Pc2 启动子-35 和-10 区域的核苷酸序列发现，Pc2A 与PcS 相似。第5 个Pc2 启动子Pc2E 发现于intI2 编码序列中［12，20］。通过对数百个第2 类整合子序列分析显示，Pc2A 和Pc2B 启动子具有多态性，Pc2变体介导基因盒转录时，效率低于典型的Pc2A和Pc2B。这一发现表明，Pc2 变体活性较弱，导致基因盒表达减少，这种现象可能与适应性成本降低有关［20-22］。

第3类整合子基因盒的表达由启动子Pc3介导，该启动子位于intI3基因内部，与第1 类整合子中启动子Pc 位置相同，启动子Pc3也存在变体。通过实验测定第3类整合子中链霉素addA2的抗性进而反映启动子Pc3强度，结果表明其强度与第1类整合子中启动子PcW+P2的强度相当［23］。

由于抗菌药物的大量使用，细菌面临更强的选择压力。Pc 启动子序列通过随机突变不断出现新变体，使基因盒能够有效表达，进而使细菌更好地适应新的变化。

2.基因盒位置效应对转录的影响

整合子中基因盒的位置对转录水平存在显著影响，基因盒越靠近Pc 启动子，其转录水平越高。早期研究者认为基因盒的转录同样受上游基因盒attC位点的调控。attC位点的特征是不完全反向重复序列，具有显著保守的回文组织［24］，转录过程中当其处于单链形式时，产生的发卡结构可能在基因盒转录过程中起到转录终止子的作用，导致下游基因盒转录水平下降。后期通过实验发现，不同的发夹结构并未影响转录本的总数量，认为基因盒的转录并不受上游attC位点的影响［25］。

3.基因盒启动子在基因盒转录中的作用

少数基因盒含有较长的5′未翻译区域，这些区域可以为基因盒提供特定的启动子，使基因盒即使远离启动子Pc，也能确保其有效表达［26］。第1 个被发现含有自身启动子的基因盒为氯霉素耐药基因cmlA1，实验证实该启动子PcmlA能有效介导cmlA1基因盒的转录并赋予载体氯霉素抗性［27］。

整合酶与整合子基因盒表达的相互作用

在第1 类整合子中，由于Pc 启动子位于intI1编码序列中［26］，其点突变导致intI1基因的非同义突变，从而引起整合酶氨基酸序列发生变化，影响第1 类整合子整合酶的重组活性。如前所述，第1 类整合子具有13 种Pc 启动子，Pc 启动子变体导致10 种IntI1编码序列，其中3 种变体引起氨基酸序列改变，突变发生在第32 和39 位，分别为IntI1R32_H 39、IntI1R32_N39和IntI1P32_H39［17］。Jové等［17］研究整合酶变体活性时发现，第32 位残基上由脯氨酸（P）替代精氨酸（R）、第39 位残基由天冬酰胺（N）替代组氨酸（H）时，整合酶剪切效率显著降低。通过对霍乱弧菌整合酶IntIA 的研究表明，这些氨基酸位于整合酶参与attC位点结合的α-螺旋结构内［28］，第32 和39 位点的氨基酸变化可能会干扰IntI1 与attC位点的结合，导致整合酶变体对基因盒的剪切效率降低。IntI1 变体对基因盒整合效率影响较小，表明对基因盒整合和剪切反应所涉及的整合酶区域可能不同。整合酶活性与基因盒表达呈负相关，即整合子需要基因盒高表达以适应外界环境时，可通过降低整合酶活性来维持整合子结构的相对稳定。这种调节机制代表了一种适应性反应，旨在降低适应性成本，有助于整合子的稳定。例如IntI1R32_H39 变体具有最有效的剪切活性，其启动子为弱启动子PcW+PcH1构型。

第2 类整合酶基因启动子PintI2位于intI2起始密码子正向40 bp 处，其基因盒功能性启动子Pc2A 和Pc2B 嵌入attI2中，Pc2 和PintI2尾对尾排列，不会发生转录干扰。大部分第2 类整合子并不能翻译成功能性整合酶蛋白，仅少数第2 类整合子具有剪切和整合基因盒的功能，这些功能性第2 类整合子的基因盒启动子类型常为弱启动子Pc2A 和Pc2B 变体，基因盒转录效率较低，说明弱的Pc 启动子决定了更有效的整合酶，这种负相关与第1 类整合子类似。第2 类整合子因此被分为两类，一类为携带Pc2A 和Pc2B 启动子，能有效表达有限的基因盒，但整合酶无活性，不能促进基因盒创新；另一类为少见的功能性第2 类整合酶，它可以捕获新的基因盒，但基因盒转录效率低。

关于第3类整合子功能的研究较少，实验证明第3类整合酶在attI3位点具有较低的识别和重组活性［23］。第3类整合子的启动子PintI3位在attI3内，基因盒启动子Pc3 位于intI3基因内，第3 类整合酶基因的表达可对基因盒的转录进行干扰［29］，从Pc3开始的转录也会影响第3类整合酶的表达，进而影响第3类整合酶的重组活性，两者相互影响。

结 语

整合子-基因盒系统的发现是人类在细菌耐药研究过程中的里程碑。大量研究显示，整合子及基因盒的表达是一个复杂且精密的过程［7，18，20］。外界环境的不断变化，使细菌处在一个选择压力下，为了快速适应压力，整合子-基因盒系统通过精细调节，为宿主细菌降低适应性负担，提供选择优势，在创造细菌多样性方面发挥重要作用。通过对整合子-基因盒系统的深入研究，发现其为细菌耐药防控带来困难的同时也为相关研究提供了新思路。