长链非编码RNA在卵巢癌中的研究进展

吴雨桐,贾英

卵巢癌是常见的妇科恶性肿瘤之一,由于其特殊的解剖位置,发病早期通常无症状,难以被发现,大多数发现即为晚期,易发生广泛转移,死亡率高,预后差[1]。70%～80%的卵巢癌患者被发现时,肿瘤已转移扩散到盆腹腔脏器,5年生存率低于50%,而早期发现卵巢癌患者的生存率可达90%[2-3]。手术联合化疗是卵巢癌患者目前的主要治疗手段,对于病变晚期的卵巢癌患者来说,其手术范围广、难度高且病灶难以完全清除[4]。大量文献报道,长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)在多种疾病及癌症的发生发展过程中存在异常调控,在细胞增殖、凋亡、细胞周期阻滞、转移、侵袭和化疗耐药中起着重要作用[5-6],本文对lncRNA在卵巢癌癌基因异常调控分子机制的研究进展进行综述。

1 LncRNA的特点

人类基因组中约有21 000个蛋白质编码基因、9 000个小RNA、10 000个lncRNA位点和11 000个假基因[7],其RNA转录物中大部分都是非编码RNA(ncRNA),ncRNA包括rRNA、tRNA、snRNA、snoRNA、lncRNA和microRNA等,它们不能翻译成蛋白质,却广泛参与人体多种生理、病理过程,尤其是癌症病变过程,通过调控基因表达参与多种分子遗传学和细胞过程,包括细胞增殖、胚胎发育和肿瘤发生等[8-9]。

lncRNA是一类长度>200个核苷酸的RNA分子,覆盖了98%的转录组[10],在转录水平、转录后水平以及表观遗传学水平上发挥着转录沉默、转录激活、染色体修饰、核内运输等重要调控作用,因其序列缺乏开放阅读框,因此不能翻译蛋白质。主要包括反义lncRNA、内含子非编码RNA、基因区间的lncRNA、启动子相关lncRNA以及非翻译区lncRNA在内的5种lncRNA。细胞核、细胞质、微循环及循环体液中均可检测到lncRNA的存在,广泛地参与肿瘤形成、转移、侵袭、耐药、复发及预后等过程[11],执行包括基因转录、基因印记、X染色体失活、核结构组织和表观遗传染色质修饰在内的多种复杂功能。就lncRNA的功能来说,① lncRNA起到miRNA海绵作用,调控靶基因表达;② lncRNA与蛋白结合,调控蛋白功能;③ 作为结构组分与蛋白形成核酸蛋白质复合体,如lncRNA与蛋白复合物结合到基因启动子区,调控基因的转录;④ 干扰邻近蛋白编码基因的表达;⑤ 抑制RNA聚合酶II,介导染色质重构和组蛋白修饰,从而影响基因表达;⑥ lncRNA与编码蛋白基因的转录本形成互补双链,在Dicer酶作用下产生内源性的siRNA,调控基因的表达水平;⑦ 结合在特定蛋白上从而改变该蛋白的胞质定位。

单一lncRNA参与多种疾病癌变过程的调控,研究发现,lncRNA TLR8-AS1在卵巢癌中表达上调,被认为是卵巢癌的致癌基因,可通过稳定TLR8 mRNA上调TLR8激活NF-kB信号通路,促进癌细胞转移及化疗的耐药性[5];在肝癌中也表达上调,但TLR8-AS1过表达可抑制miR-34的成熟,从而抑制肝癌细胞的增殖和迁移[12]。此外,MIR99AHG在胰腺癌中明显过表达,转录因子叉头盒A1(FOXA1)可诱导MIR99AHG上调,分泌miR-3129-5p并募集ELAVL1调节NOTCH2/Notch通路信号从而加速胰腺癌的进展[13],还可通过miR577/FOXP1轴抑制凋亡促进胃癌的发生发展[14]。

2 LncRNA在竞争性内源RNA网络中发挥的作用

组织癌变过程中存在蛋白编码和非编码转录物的异常表达,非编码转录组中包括lncRNA和假基因,均含有microRNA(miRNA)反应元件(microRNA response element,MRE),研究表明lncRNA可作为天然的miRNA分子海绵调节基因表达,这些非编码RNA参与的竞争性相互作用调节称为竞争性内源RNA(competing endogenous RNAs,ceRNA)网络,网络中分子间的功能是相互作用的,任一分子受到干扰出现异常表达,均可能造成庞大复杂的调控网络出现障碍,从而诱发疾病[15]。近期的研究证实lncRNA SND1-IT1可竞争吸附与miR-1245b-5p结合,从而促进泛素特异性蛋白酶3(USP3)信使RNA(mRNA)表达,USP3可介导蜗牛家族转录阻遏物1(SNAIL1)去泛素化,从而增强GSE-1细胞出现恶性转化[16];Liu W等[17]通过双荧光素报告分析、RNA结合蛋白免疫沉淀(RIP)和生物素化RNA下拉分析等实验发现LINC00974的过表达可促进卵巢癌细胞的增殖和转移,敲除miR-33a可在一定程度上抑制LINC00974的作用,利用数据库明确高迁移率族框2(HMGB2)为miR-33a的直接靶基因,LINC00974可作为ceRNA直接与miR-33a结合,上调HMGB2,促进卵巢癌细胞的增殖、转移和上皮-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT);此外,牛磺酸上调基因1(TUG1)也可作为ceRNA吸附miR-1-3p,促进IGF1的表达,从而促进肝癌细胞的增殖、转化和侵袭[18]。

3 LncRNA在卵巢癌中的相关研究

3.1 卵巢癌致癌相关lncRNA

卵巢癌发生是多步骤的基因突变、多种内外因素作用以及代谢调控紊乱等多种因素共同作用的结果,lncRNA在卵巢癌癌变过程中的多个环节发挥着不可忽视的致癌基因的作用。Xie X等[19]通过RT-qPCR法检测发现,与正常组织相比,卵巢癌组织中KTN1-AS1的表达增加,并通过流式细胞术等实验加以验证,经USSC数据库、CHIP法证实H3K27ac可诱导KTN1-AS1,而后通过starBase数据库、RT-qPCR法、荧光素酶报告基因实验证实KTN1-AS1在卵巢癌中与miR-505-3p相互作用(P<0.05),ZNF326是miR-505-3p的靶基因(P<0.05),通过集落形成实验、流式细胞术等实验验证KTN1-AS1通过增加ZNF326水平促进卵巢癌细胞生长。最终得出结论:H3K27ac可诱导KTN1-AS1的表达,基于ceRNA网络KTN1-AS1/miR-505-3p/ZNF326轴发挥促进卵巢癌细胞增殖、迁移及侵袭转移等致癌过程。研究揭示LINC00665在人卵巢癌SKOV-3和OVCAR-3细胞系中表达水平增高,Western blot实验、伤口愈合实验、流式细胞术及transwell分析显示敲除LINC00665可降低SKOV-3和OVCAR-3细胞周期蛋白D1的表达,增加p21的表达,抑制卵巢癌细胞的增殖并促进凋亡(P<0.01),利用LncBase数据库、Targetscan数据库预测得到LINC00665的靶基因miR-181a-5p、FHDC1,并通过体外实验加以验证,最终证实LINC00665基因可通过miR-181a-5p/FHDC1轴促进卵巢癌的发生[20]。

癌症易感候选基因15(CASCA15)是一种新发现的致癌lncRNA, Lin H等[21]通过TCGA、GEO数据库以及将CASC15特异性的短干扰RNA(siRNA)转染到卵巢癌细胞系中证实CASCA15高表达的卵巢癌患者的总体生存率(OS)比低表达的患者差,表明过表达CASCA15将降低卵巢癌患者的生存时间。DICER是一种可将miRNA切割成成熟形式的关键RNase III酶,对其进行RIP-seq分析,将得到的lncRNA命名为卵巢DICER相关T转录物1(DATOC-1),通过体外实验证实DATOC-1高表达可促进上皮性卵巢癌(epithelial ovarian cancer,EOC)的进展,并设置体内实验构建异种移植瘤模型加以验证,利用AnnoLnc数据库预测可能的靶向miRNA,最终证实DATOC-1可能与DICER作用从而影响miR7促进EOC的进展[22]。Li B等[23]通过体外实验证实PART1在卵巢癌组织中过度表达(P<0.001),FIGO分期越高、组织转移越多者PART1的表达量越高(均P<0.01),由StarBase软件预测下游靶基因miR-503-5p(P<0.001,R2=0.665)和FOXK1(P<0.001,R2=0.6138),最后进行体内实验发现低表达PART1可通过miR-503-5p/FOXK1轴抑制卵巢癌的细胞增殖、迁移和侵袭能力。

3.2 卵巢癌抑癌相关lncRNA

在卵巢癌病变过程中,并不是所有lncRNA的突变都会造成其转移、促进癌细胞增长,一些特殊lncRNA的异常表达可抑制癌细胞的增长和侵袭。研究表明LINC00261在高级别浆液性卵巢癌(high-grade serous ovarian cancer,HGSOC)中表达上调[24],敲除卵巢癌细胞系中的LINC00261基因可使miR-552显著上调,miR-552作用于ATG10诱导EMT表型从而促进HGSOC进展,因此,LINC00261的过表达可通过miR-552/ATG10/EMT轴抑制HGSOC细胞的增殖、迁移能力;lncRNA生长阻滞特异性转录物5(GAS5)被认为是卵巢癌抑癌基因的一种,生物信息学分析、双荧光素酶报告基因分析等实验表明,miR-96-5p可以特异性地结合GAS5,GAS5的过表达可抑制miR-96-5p的表达从而显著降低卵巢癌细胞的增殖和侵袭能力[25]。

3.3 卵巢癌转移相关lncRNA

卵巢癌细胞的广泛转移是造成临床治疗及预后差的主要原因之一,充分探索卵巢癌转移的分子机制可进一步提高患者的5年生存率。Lu Y等[26]明确BC041954 基因在卵巢癌组织中存在高表达,根据BC041954的中位表达水平将患者分为高表达组和低表达组,发现BC041954基因高表达的患者在远处转移中更为常见(P=0.031)。研究表明,过表达CASCA15将降低卵巢癌患者的生存时间,向小鼠腹腔内注射稳定转染CASCA15的SKOV3细胞,在第5周时对小鼠进行生物发光成像,敲除CASCA15基因组全身发光信号比对照组大约低6倍,小鼠模型实验显示CASCA15基因敲除可显著降低腹腔内转移结节的数量,强烈支持CASCA15作为卵巢癌转移启动子的作用[21]。

3.4 卵巢癌放化疗耐药性相关lncRNA

多数卵巢癌患者放化疗后期均会出现不同程度的耐药现象,导致治疗效果欠佳。研究发现,顺铂耐药的卵巢癌细胞中HOXA11-AS 基因表达显著上调,qRT-PCR、细胞计数试剂盒-8(CCK-8)、流式细胞术等实验方法敲除HOXA11-AS 基因可导致卵巢癌细胞周期的停滞,诱导晚期凋亡和自噬,进一步增强卵巢癌细胞对顺铂的敏感性,自噬调节因子P62、Beclin1和LC3的水平发生变化可影响卵巢癌患者的进展及预后[27]。Lin C等[28]发现ACTA2-AS1在顺铂耐药的卵巢癌细胞和组织中表达增加,利用qRT-PCR实验证实敲除ACTA2-AS1可降低卵巢癌细胞对顺铂的耐药,双荧光素酶报告基因分析、CCK-8、Elisa分析表明ACTA2-AS1的低表达可增强miR-378a-3p的表达,并观察到卵巢癌细胞中Wnt5a显著增加,最终确定lncRNA ACTA2-AS1可通过ACTA2-AS1/miR-378a-3p/Wnt5a轴发挥在卵巢癌细胞中的顺铂耐药作用。通过对包括TCGA数据集、癌症基因组图谱、11例卵巢癌样本在内的外部数据集和39例卵巢癌样本的内部数据集筛选出与卡铂耐药性相关,且存在差异基因CpG位点(DMP)的基因SNHG12(P<0.05),对SNHG12进行功能分析发现下调SNHG12可增加卵巢癌IGROV1、OVC316和OVCAR8细胞系对卡铂的敏感性,是卵巢癌一个潜在的治疗靶点[29]。

3.5 卵巢癌预后相关lncRNA

Wang X等[30]从ImmPort数据库获取免疫相关lncRNA,构建基于8个免疫相关lncRNA的卵巢癌预后预测风险模型,并通过TCGA数据库测试集验证模型的稳定性,分析1年、3年和5年的预后预测分类效果,得出该预后预测模型可以更好地评估卵巢癌患者的预后,还可以评估高、低风险人群中不同药物的治疗效果。qRT-PCR法检测发现,与正常卵巢组织相比,BC041954在卵巢癌组织中的表达增加(P<0.001),Kaplan-Meier分析表明BC041954高表达的患者总体生存期较正常表达或低表达的患者显著降低(P=0.008),且在多变量Logistic回归分析中,BC041954基因的高表达为卵巢癌患者预后不良的独立危险因素[26]。Nie X等[31]使用最优密度算法确定TCGA-OV数据集及21个N6甲基腺苷(m6A)相关基因表达谱,确定差异表达的lncRNA,使用单因素cox回归分析、LASSO回归、多因素cox回归构建与卵巢癌患者相关基于m6A和lncRNA的预后风险评分模型,并利用GEO数据库中的GSE26193和GSE9891数据集进行验证,证实基于13个与m6A相关lncRNA构建的风险评估模型在预测卵巢癌患者的总体生存期中具有良好的能力及稳定性。

3.6 与lncRNA有关的卵巢癌的药物治疗

探索卵巢癌致病分子机制的目的是为寻找有效的靶向药物,提升患者的5年生存率。目前,针对卵巢癌病变过程中lncRNA PVT1的过表达,氯胺酮处理后可显著降低其表达,通过诱导癌细胞周期阻滞、凋亡抑制其克隆形成能力,明显抑制卵巢癌细胞的增殖和生存[32];抗疟原虫药物伊维菌素最近发现可用于抑制卵巢癌的进展,浓度20μm～30μm的伊维菌素可通过调节lncRNA-EIF4A3-mRNA轴显著抑制卵巢癌细胞系的细胞迁移[33];结肠癌相关转录物2(CCAT2)被发现在卵巢癌中扩增过为频繁,骨化三醇与维生素D受体(VDR)蛋白相互作用,骨化三醇可抑制CCAT2过表达从而阻碍与转录因子TCF4相互作用来激活MYC基因的启动子来调节MYC的表达,从而抑制卵巢癌细胞的增殖、迁移和转移[34],维生素D有望成为一种便宜且有效的新型抗卵巢癌药物。

4 小结与展望

近年来,越来越多的lncRNA在癌症中表达水平存在异常被逐渐探索证实,lncRNA在表观遗传、转录、翻译、RNA代谢调节、细胞自噬与凋亡、干细胞维持与分化、胚胎发育等方面发挥着重要作用,在不同细胞类型和物种间的流行度、丰度、生物发生和生物功能方面的研究取得了重大进展[35],但由于基因调控的复杂性,其具体的作用机制仍较为模糊。迄今为止,包括卵巢癌在内的多种癌症病变过程中,lncRNA发挥的作用正在逐渐被揭露,包括lncRNA参与调节的ceRNA网络研究、甲基化研究,是目前的研究热点。lncRNA的表达具有组织及细胞特异性,参与卵巢癌的致癌、抑癌、转移、放化疗抗性、诊断、预后及复发的全部过程,探索lncRNA对卵巢癌的诊治具有重要的临床意义,可用于开发新疗法、新型靶向药物以及更具有诊断意义和预后生存评估的指标,lncRNA在癌症研究中的临床转化会在未来发挥更重要的作用。