含藻人工多细胞体系的构建及其在废水处理中的应用

王玉娇,赵权宇

(南京工业大学 药学院,江苏 南京 211800)

合成生物学是生命科学的前沿领域[1],合成生物学研究内容包括元件挖掘、DNA合成、组装和基因组编辑等,人工多细胞体系的研究也是合成生物学的重要部分。人工多细胞体系从细胞层面构建复杂的系统,丰富合成生物学的内涵与应用。光合细菌或微藻利用光能,通过光合作用固碳、产糖或油脂。在厌氧条件下,光合细菌等可利用H2S、H2或者有机物等作为氢供体还原CO2;微藻等则利用水作为氢供体还原CO2,并放出O2。微藻具有比高等植物更高的光合固碳效率[2],因此,以微藻作为底盘或构建含微藻的多细胞体系是合成生物学的重要研究方向。

在多细胞体系中引入光合微生物或微藻,可以部分摆脱其对外源碳源的依赖,形成更为复杂的高效系统,并具有部分自维持的功能,该变化引起研究人员越来越多的关注。微藻既包括原核生物,也包括真核生物,有异于细菌和酵母等微生物的代谢途径,是具有自身特点的底盘。此外,活性污泥和高效藻类塘(HRAPs)[3]等都属于多细胞体系,在废水处理领域有着多年的应用。虽然通过宏基因组等手段可以分析活性污泥和HRAPs的微生物构成和动态变化,但仍需进一步研究,从中获得足够的信息,以指导构建新的、稳定的多细胞体系[4]。从合成生物学角度来说,格物才能致知,造物才能致用：一方面,需要由下至上地深入了解这些方法,获取相关生物学原理;另一方面,需要由上至下地设计更高效的多细胞体系用于废水处理等体系的实际应用[5]。所以,迫切需要厘清如何构建含藻多细胞体系及其内在作用机制等核心问题。本文综述近年来包含微藻的人工多细胞体系构建、废水处理和形成机制等方面的进展,并对其研究及应用前景进行展望。

1 人工光合多细胞体系的构建

合成生物学具有典型的“工程学本质”,自下而上地构建新的“人造生命”[6]。传统的合成生物学以具有特定功能的氨基酸或核苷酸序列——元件为基础,通过类似乐高搭建玩具的模式,由元件构成途径(模块),再由途径(模块)构建底盘细胞。借鉴这样的概念,在多细胞体系中,每个微藻或微生物都是一个功能完备且可以独立生存的元件,通过共培养等方式组成更为复杂的模块,再形成生物群落——底盘。这些微藻或者微生物都是可以标准化的,更关键的是如何构成新的多细胞模块和底盘,因为模块和底盘在尺度和复杂性上存在差别。需要指出的是,只有构成光合多细胞体系的适配才能形成高效、稳定的系统。藻和菌都可直接应用于构建多细胞体系,与生物元件来构建有本质区别。

从多细胞体系的结构复杂性来讲,光合多细胞体系可以分为简单的共培养体系构建和复杂的生物群落构建(图1)。共培养是微藻细胞游离化培养,而生物群落具备一定的结构,比共培养更稳定。

图1 光合多细胞体系的构建Fig.1 Construction of photosynthetic multiple cell system

1.1 共培养体系的构建

共培养是最简单的多细胞体系,通常是不同微生物在液体培养基中混合培养。在实验室内共培养可以评价微藻与其他微生物的相互作用,探索构建光合多细胞体系的可能性。此外,在废水处理等实际应用中,高效藻类塘中微藻和微生物也是以共培养的游离形式存在。微藻和微生物能否共培养,有众多制约条件。一方面,藻菌共培养后生物量如果优于纯培养,则说明藻和菌之间无抑制作用。另一方面,面向废水处理的需要,共培养体系去除目标污染物的能力应优于纯培养体系。

构建微藻和微生物的共培养体系,除了要考虑选择藻和菌的种类外,温度、光照等培养条件和藻-微生物的比例也非常关键。如,Gonçalves等[7]将集胞藻(Synechocystissalina)与小球藻(Chlorellavulgaris)、羊角月牙藻(Pseudokirchneriellasubcapitata)或铜绿微囊藻(Microcystisaeruginosa)共培养后发现,当将集胞藻和小球藻共培养后,生物质产率和氮去除率显著高于其他共培养组合以及纯培养组,但是集胞藻-铜绿微囊藻共培养组的磷去除率和油脂产率最高,可见藻种是影响共培养的关键条件之一。Arias等[8]将蓝藻和栅藻等绿藻共培养后发现,藻的组成处于动态变化中,主要受到操作条件和营养条件的影响。Silaban等[9]研究发现,碳源、碳氮比和光条件也会影响纤发鞘丝蓝细菌属(Leptolyngbyasp.)与小球藻的共培养情况。Huo等[10]发现,添加不同比例的弗留明拜叶林克氏菌(Beijerinckiafluminensis),污染物的处理效果不同,其中添加10%的B.fluminensis效果最好。García等[11]在养猪废水中分别接种极微小球藻(Chlorellaminutissima)、富油栅藻(Acutodesmusobliquus)和颤藻(Oscillatoriasp.),连续观察半年后发现：接种小球藻和富油栅藻的实验组中均出现了小球藻、富油栅藻和杂藻Aphanothecesp.;接种颤藻的实验组中以小球藻和富油栅藻为主,而未接种的实验组中小球藻是主要的微藻。该结果表明,在开放式培养过程中主导微藻与接种微藻并不一致,有些杂藻会进入系统,同时由于废水中含有微生物,实际上是藻-菌的混菌培养。为提高系统的稳定性和对环境压力的耐受性,藻菌复合体的适应性实验室进化是可行的方法[12-14]。

1.2 有序多细胞体系的构建

合成生物学的根本目标是应用分子生物学技术和组合策略构建新途径和生命体。在搅拌的条件下,简单的共培养体系中藻菌均匀分布,对环境的耐受性差,采收困难。而构建具有一定结构的有序多细胞体系,可以提高对环境的耐受性和采收效率,降低生产成本,更重要的是可以通过构筑有序结构,精准调控其功能。已经构建的含藻有序多细胞体系包括微藻固定化、藻菌絮体(Mab-flos)、含藻颗粒污泥和含藻生物膜等。

现有的固定化方法中,既有纯藻的固定化,也有藻-菌共固定化[15-16]。海藻酸钠包埋法是常见的微藻固定化方法。Hu等[17]通过调控藻菌的接种量、海藻酸盐浓度及制备方法等来调控藻菌的包封率以及颗粒大小,一般尺寸在毫米尺度。虽然海藻酸钠包埋法固定的优点是抗剪切能力提高,但是随着微藻生长和多次培养,胶球容易破碎,同时包埋法需要海藻酸盐等,操作成本也较高。

与之相比,藻菌絮体、颗粒污泥和生物膜属于自固定化。Mab-flos是藻和菌等形成的絮状结构,结构松散,尺寸为100～1 000 μm[18-19]。白天在光生物反应器内悬浮,晚上则沉在光生物反应器底部。van den Hende等[20]直接从废水处理厂采集部分Mab-flos,最终发现,Mab-flos的人工构建研究还不完善。合成生物学的观点认为,只有制造它才能充分认识它,所以需要从Mab-flos的藻和微生物组成、形成条件、结构和动态变化等方面深刻认识光合多细胞体系的构建条件。Loria等[21]将藻和活性污泥按照一定比例混合培养2 h就可获得Mab-flos,其中,栅藻和活性污泥形成的Mab-flos脱磷的效果显著好于小球藻的。可见,Mab-flos除了便于采收优点外,藻和菌的接触比单细胞的游离培养要紧密,有利于藻-菌之间物质和能量的传递。

由于藻菌絮体的结构较为松散,所以在废水处理等过程中,藻菌絮体的结构一直处于动态变化中,藻菌絮体中的菌可以是纯菌,也可以是多种微生物混合体。Yang等[22]发现,含藻颗粒污泥是微藻和活性污泥形成的颗粒状多孔结构,尺寸比藻菌絮体更大,达0.5～2.5 mm,或者更大。在含藻颗粒污泥的形成过程中,一般先形成藻菌絮体,再经过丝状藻或菌的交缠,形成更大且更稳定的颗粒[23-24]。He等[25]先将微藻与活性污泥混合,在一定条件下培养后,制备得到含藻颗粒污泥,其中,光强等会影响含藻颗粒污泥的形成。Zhang等[26]利用菌丝球包裹微藻形成菌丝球裹藻凝结核,快速构建自维持菌藻共生好氧颗粒污泥,将颗粒污泥的制备时间控制在12 d以内,粒径约为3.3 mm。Dong等[27]研究发现,盐度等条件也会影响含藻颗粒污泥的稳定性。

在自然水体中的固体表面上,就存在生物膜。同时,包埋颗粒、藻菌絮体和颗粒污泥需要搅拌才能在光生物反应器中悬浮起来。所以,针对面源污染时,虽然常规处理方法的应用受到一定限制,但是生物膜法可以稳定发挥作用。Liu等[28]发现,生物膜的形成与藻菌的种属特性、支撑材料表面性质和培养基组成等相关。Barros等[29]在考察铜、玻璃、AISI316不锈钢、聚甲基丙烯酸甲酯、聚苯乙烯和聚氯乙烯等材料作为微藻生物膜的载体时发现,不锈钢作为支撑材料有利于微藻生物膜的形成,铜绿微囊藻容易贴壁,而羊角月牙藻的贴附性差。Zhao等[30]以棉布、尼龙过滤布、纱布、绒布、海绵和土工布作为贴附材料,结果发现,栅藻在土工布上贴附后生物量最高。Cheng等[31]发现,如果贴壁基质是醋酸纤维素/硝酸膜,在12种微藻中小球藻形成生物膜的能力最强。小球藻是常见的固碳和废水处理微藻,会分泌胞外多糖,有利于形成生物膜。Zheng等[32]发现,栅藻与镰形纤维藻(Ankistrodesmusfalcatus)可以先共絮凝,这加快了生物膜的生成速度。

此外,通过3D打印等新型技术手段来理性合成具有精准结构的多细胞体系,可以提升稳定性[33]。Zhao等[34]将藻3D打印后形成的多细胞体系固定化单元,可以作为微小的多细胞工厂,应用于环境治理等领域。3D打印与包埋固定化方法接近,成品的形状多样。目前,3D打印的成本还较高。

2 人工光合多细胞体系的解析

人工光合多细胞体系的构建目前还处于发展阶段,因此,需要综合考虑体系内微藻与微生物的适配性、多细胞体系的稳定性及功能。一方面,可以通过扰动等手段获取已经建立的多细胞体系对外部胁迫的响应,分析生物群落的组成变化以及内部的相互作用,这是由上至下的研究方法;另一方面,可以将多细胞体系作为整体考虑,选择适当的微藻和微生物,实现响应功能,由于微藻和微生物均是独立个体,具有各自的代谢系统,这是由下至上的研究方法。

2.1 已知体系的组学分析(自上而下)

实验室规模的共培养往往仅有几种藻或微生物,而高效藻类塘等水体中含有的微生物种类繁多,通过高通量测序可以获得体系内的主导微藻和微生物信息以及生物群落动态变化。

Mark Ibekwe等[35]研究处理农业废水的高效藻类塘中发现：占优势的微生物是蓝藻,α-、β-、γ-、ε-和δ-变形菌,拟杆菌,厚壁菌和扁平菌;水力停留时间、总氮(TN)、总无机氮、总磷(TP)、碱度、pH、总悬浮固体和挥发性悬浮固体等环境变量均会影响微生物群落。Trebuch等[36]发现,虽然水力停留时间会影响废水处理中光合颗粒的组成和功能,但对颗粒形成最关键的两个因素是胞外多糖的分泌和微生物组成,起到关键作用的微生物包括湖丝藻(Limnothrix)和生物膜生成菌等。He等[25]用自然光诱导形成颗粒污泥,结果发现,占主导地位的微藻从硅藻转变为绿藻。Zhang等[37]发现,为响应温度的波动,颗粒污泥中会富集β-和γ-变形菌以及黄杆菌、绿藻和硅藻等,而蓝藻占比低。一般来说,生物群落包含的微生物种类多有利于提高系统的鲁棒性,但是为达到废水处理的目的,现在还没有理性途径辅助选择藻种和细菌等微生物的种类以及确定藻菌的比例。

2.2 基于相互作用的分析(自下而上)

多细胞体系的构建虽基于细胞水平,但比底盘或路径的构建更复杂。叶绿体是微藻进行光合作用的细胞器,也是胞内能量的转化器。微藻在人工多细胞体系中也发挥光能转换的作用。从功能来说,微藻是整个体系中可以进行光合作用的部分。引入微藻后,多细胞体系就可以利用光能作为部分能源来源。构建人工光合多细胞体系的关键之一就是要选择合适的微藻,如蓝藻等原核微藻,或者绿藻等真核微藻。除了光合作用外,微藻和微生物的代谢有不少差异,可以互相补充和协作(图2)。微藻和微生物都可以独立存活,环境和营养条件的胁迫等对微藻和微生物的调控可能是不同的,所以需要具体分析详细的作用机制。只有深入理解这些相互作用,才能有助于基于合成生物学原理构建高效的人工光合多细胞体系。

AHLs—N-酰化高丝氨酸内酯图2 藻菌之间的相互作用Fig.2 Interactions between microalgae and microorganisms

2.2.1 代谢互补

微藻以自养生长为主,而细菌多数是异养生长,因此利用两者之间的代谢互补可以拓展含藻光合多细胞体系的底物利用范围。一般来说,微藻不能利用甲烷,而噬碱甲烷菌可以固定甲烷,并产生CO2,因此通过藻菌共培养就可以减少甲烷排放[38]。虽然部分微藻可以异养生长,但是只能利用少数有机碳源。如,小球藻不能利用蔗糖,而黏红酵母可将蔗糖分解为葡萄糖和果糖,小球藻再利用葡萄糖和果糖,从而形成了藻菌异养培养系统。Wang等[39]对比了共培养与纯培养工艺后发现,共培养后微藻细胞数量提高了45%。Xie等[40]将小球藻和纤维弧菌(Cellvibriopealriver)共培养后发现,纤维弧菌可以利用木聚糖,并分泌促进小球藻和衣藻生长的物质,因此整个多细胞体系可以木聚糖作为碳源,这是微藻纯培养无法实现的。

2.2.2 代谢协同

代谢协同表现在调控基因表达、促进絮凝和消除氧化压力等方面。藻与菌的相互作用可以通过显著提升相关基因的表达,最终促进某些产物的合成。微藻在生物群落中可以提供有机碳,或者其他物质,促进微生物的生长[41]。Ashtiani等[42]将黏红酵母和小球藻以2∶1的比例接种共培养后发现,小球藻内的乙酰辅酶A羧化酶和甘油-3-磷酸乙酰转移酶相关基因表达显著上调,同时神经酸和正二十二烷酸的含量也大幅增加。Xue等[43]将念珠藻和鱼腥藻共培养后发现,蓝藻生长、胞外多糖和胞外蛋白生产、固氮能力和光合活性等方面都产生显著改变。因此,共培养体系中微生物之间的相互作用规律是复杂的,需要通过代谢组或代谢指纹图谱等手段进行全面分析[44]。Lakshmikandan等[45]利用链霉菌Streptomycesrosealbus分泌的吲哚乙酸促进微藻生长、脂类富集以及藻类絮凝,这样有利于藻的采收。利用微生物促进藻类絮凝,不仅可以降低采收成本,而且更有利于工程化放大和大规模应用[45-46]。

固氮螺菌Azospirillumbrasilense是植物促生菌。由于铜离子或氮缺乏会使微藻胞内产生活性氧(ROS),因此Peng等[47]将小球藻与固氮螺菌共培养后发现,固氮螺菌分泌的吲哚乙酸降低了小球藻内活性氧的累积。大肠杆菌是非植物促生菌,而巨大芽孢杆菌B.megaterium是潜在的植物促生菌,Peng等[48]将两菌共培养后发现,这两株菌都可以促进小球藻的生长。因此,除了分泌植物激素外,藻与菌之间的CO2与O2交换和维生素B的交换也是非常重要的。微藻的产氢酶对O2敏感,容易失活。利用微生物快速消耗O2的特性,可以形成厌氧环境,有利于微藻产H2[49]。Cho等[50]将生丝单胞菌Hyphomonassp.产生的二甲基二硫醚、二甲基三硫醚和吲哚等挥发性物质通入微藻培养装置后发现,这可促进小球藻的生长,并改善了脂肪族化合物的组成。藻和菌在废水处理中均可以发挥各自的作用。Nguyen等[51]研究发现,小球藻和活性污泥共培养后提高了处理合成废水的效率,其中,微藻主要去除总氮,而活性污泥主要是去除化学需氧量(COD)[51]。

2.2.3 代谢竞争

需要注意的是,在藻与菌之间也存在营养方面的竞争,如,氮磷是藻和菌均需要的营养物质。Ferro等[52]用小球藻-根瘤菌共培养处理市政废水时发现,藻与菌会竞争利用废水中的氮磷。Corcoran等[53]发现,星空藻Coelastrellasp.分泌化感物质,在共培养时会抑制小球藻的生长。细菌等微生物的快速生长,也会造成培养基浊度上升,影响微藻对光的利用,特别是室外废水处理过程,往往会存在杂藻,这种效应更明显。Liu等[54]在处理园艺废水时接种丝状的克里藻Klebsormidiumsp.和毛枝藻Stigeocloniumspp,结果发现,毛枝藻在与废水中微藻竞争时生长良好,但是同样条件下的克里藻却无法生长。

2.2.4 群体感应

除了代谢水平的相互作用外,藻与菌之间也存在信号分子交流[55]和水平基因转移[24]。细胞与细胞间的通信行为被称为群体感应。细菌分泌的信号分子包括N-酰化高丝氨酸内酯(AHLs)、氨基酸和短肽类物质以及呋喃酰硼酸二酯等。细菌的群体感应主要调控生物发光、生物被膜形成、孢子形成以及产生毒力。相对来说,关于微藻群体感应的研究还不多,现有研究表明,群体感应的影响主要体现在与微藻生长相关[56-58]、油脂合成[59]、促进贴壁[60]和修复光合作用[61]等方面。

Das等[56]发现,从厌氧活性污泥中提取的群体感应信号分子可以将小球藻的生物质产率和油脂产率分别提高2.25和1.28倍。Pande等[57]从扁藻Tetraselmissuecica和牟氏角毛藻Chaetocerosmuelleri培养液中分别分离出可以产生AHL降解酶的假单胞菌和芽孢杆菌,研究发现：如果将假单胞菌或假单胞菌+芽孢杆菌加入扁藻培养液中,均促进微藻生长;单独加芽孢杆菌对牟氏角毛藻生长的影响不大,但是加入假单胞菌+芽孢杆菌,该藻的生长就被抑制,说明群体感应信号分子对藻生长的影响存在种属差异。N-己酰基-DL-高丝氨酸内酯是C6-HSL群体感应分子。Zhang等[58]发现,C6-HSL会抑制小球藻和栅藻的生长,但是对共培养的小球藻+栅藻,C6-HSL的抑制作用会降低。Zhang等[59]发现,在Chlorophytasp. FACHB-729的培养基中加入从活性污泥中提取的化感物质会轻微抑制其生长,但是油脂含量提高了84%。Zhang等[60]发现,AHLs会促进胞外高聚物(EPS)的分泌,有利于含藻颗粒污泥的形成。Zhou等[62]研究发现,在悬浮培养的Chlorophytasp.培养液中加入C6-HSL后,引起微量的蛋白分泌量增加,最终自絮凝成200 μm的絮体。AHLs通过促进微藻分泌EPS从而实现藻体聚集的现象在颤藻[63]或颗粒污泥[64]中也存在。

由此可见,群体感应在人工光合多细胞体系的构建中能发挥重要作用,但是群体感应信号分子众多,相关研究还有待进一步深入。

3 光合多细胞体系在废水处理中的应用

代谢过程包括合成代谢与分解代谢。光合多细胞体系可发挥合成和分解代谢的作用,分别用于化学品合成与环境治理,特别是在有机污染物、抗生素等有害污染物以及重金属离子的去除中发挥重要作用。分解和合成代谢相辅相成,并不矛盾。如,微生物可以在修复环境的同时产生油脂等产品。因此,本文就光合人工多细胞体系在废水处理中的应用进行讨论。微藻和微生物均可以去除废水中的氮磷和重金属,微藻还可以固定CO2。因此,光合多细胞体系已经用于废水处理、CO2固定等领域。一般来说,微藻和细菌等快速生长后,不仅可以获得更多的生物量,更有利于去除废水中的氮磷和重金属,或者固碳。为了提高系统的稳定性,减少处理后出水中的微藻流失等问题,已经开发了多种模式,包括普通的共培养体系、固定化、藻坪净水系统(ATS)、HRAPs、藻菌絮体和生物膜,近些年相关的研究成果总结在表1中。

表1 光合多细胞体系废水处理情况汇总

由表1可知：小球藻在废水处理中应用广泛;而丝状藻[66,75]的沉降较快,便于采收,也是应用较广的微藻;或者共培养的微藻和丝状真菌,也有利于采收[76]。活性污泥法是生物法废水处理的最基本方法,也常与藻进行共培养。活性污泥是较为稳定的微生物多细胞体系,但是其组成复杂。Qi等[77]通过宏基因组分析活性污泥的组成后,挑选与其中丰度最高的微生物类似的菌种进行人工模拟发酵体系处理废水后发现,3株菌与小球藻共培养比菌或藻的纯培养处理效果要好,为合理构建光合多细胞体系提供了有益的参考。但是共培养往往存在菌和藻的流失,系统稳定性较差。ATS也是藻与菌固定化的一种方式,一般漂浮在水体表面,对面源水体污染的处理具有一定优势。虽然ATS是由微藻、细菌和真菌等组成,但是人工诱导ATS的形成条件还不明确。利用藻和菌去除有机小分子、氮磷都是将其作为底物,因此构建多细胞体系的重点是提高对污染物的耐受性,并使菌体快速生长。

在微藻和菌中含有降解酶,可以降解酮基布洛芬等[78]抗生素。藻与菌的共培养,一方面可提高其对抗生素的耐受性,另一方面可以协同降解抗生素,并提高降解率。含藻生物膜系统在降解磺胺类抗生素的同时,还可以去除氮磷[79-80]。

锌和铬等重金属离子是微藻或微生物生长所需的[81-82],但是被利用的总量有限。在利用微藻和微生物去除重金属离子时,除了考虑其生物利用外,还要注意EPS吸附等作用。Makut等[83]比较了藻、菌以及藻与菌共培养对铜、铬、镉、镍和铅等重金属离子的去除效果,结果发现,共培养显著优于单一微藻或纯菌的去除效果。因此,合理构建多细胞体系需要明确藻和菌的单独作用效果以及相互作用效果。

4 结论与展望

人工多细胞体系是合成生物学的重要研究方向之一。微藻作为可自养的光合生物,在人工多细胞体系中发挥独特作用。光合人工多细胞体系需要借鉴HRAPs等,提出新的构建策略,形成稳定、高效的系统,并在物质、能量和信息等多个层面解析和揭示其分子机制。利用系统生物学、合成生物学最新的成果与工具,不断丰富含藻光合人工多细胞体系理论基础和技术手段。

1)面向实际需要,构建高效光合多细胞体系。在废水处理过程中,微藻很难保证纯种培养,藻与菌的共培养是更现实的选择。虽然活性污泥-微藻的集成过程优于单独的活性污泥法,但是微藻培养过程成本高、受环境影响大的问题仍需要克服。在废水处理过程中,由于污染物众多,对净化效果的要求不断提高,所以开发更全面的微藻光合多细胞体系仍然是艰巨的工作。

2)从过程工程角度,维持多细胞体系的稳定运行。在构建光合多细胞体系后,随着培养的进行,藻与菌的比例会产生变化,所以需要从环境条件和营养条件等方面精准控制多细胞体系的群落组成,使之稳定运行。同时,由于微生物生长速度快,随着培养时间的延长,培养基的光透过性降低,将会影响微藻的光合作用,因此需要设计更合理的光生物反应器来提高微藻的光利用效率。

3)探究光合多细胞体系的形成机制,向定量化合成生物学迈进。微藻与细菌构成光合多细胞体系,不仅需要维持稳定的结构,还要精准调控其功能。从基因组、转录组、蛋白质组、代谢组和微生物组等多层次,详细分析其形成的基因、蛋白、代谢物及群落水平上的分子基础。利用多尺度手段,从基因—细胞—群落水平构建定量化模型,准确解析其动态调控过程。

4)解析现有多细胞体系作用机制,以真正实现由格物致知到造物致用。分析藻菌絮体等现有多细胞体系的微生物组成和结构,模块化构建新的光合多细胞体系,根据实际应用的需要,组装这些结构和功能的模块——细胞层面的元件,构建新的高效系统。