黑皮冬瓜果实生长及糖类物质变化规律

焦加斌，李金隆,2，常静静，李静，陈潇，宋钊，何裕志，张白鸽

（1广东省农业科学院蔬菜研究所/广东省蔬菜新技术研究重点实验室，广州 510640；2福建农林大学资源与环境学院国际镁营养研究所，福州 350002）

0 引言

冬瓜为一年生蔓生草本植物，又称东瓜、白瓜、白东瓜皮、白冬瓜、白瓜皮、白瓜子、地芝，是葫芦目葫芦科蔬菜，原产于中国南部及印度，现在东亚和南亚地区广泛栽培，2018年，国内的冬瓜年播种面积33.33万hm2，主要分布在广东、广西、湖南、海南、江西等地[1-2]。尽管冬瓜在中国有2000年以上的栽培历史，其药用功能方面已有较多研究报道[3-5]，但由于从事冬瓜研究的人员相对较少，其生长发育和栽培等相关研究工作开展较晚，其研究的深度和广度均落后于番茄、黄瓜等大宗蔬菜作物[6-7]。果实的生长发育和碳水化合物的累积转化规律是高产优质栽培的理论基础[8]，但目前在冬瓜上还缺乏相关研究报道。

糖类物质是生物体内的主要碳源，可为生物体提供能量，同时糖的种类及含量与果实品质密切相关[9-10]。在蔗糖代谢中，转化酶、蔗糖合成酶和蔗糖磷酸合成酶可调控蔗糖分解与合成反应，其活性变化决定了果实中的糖代谢进程和糖组分[11]，这在葫芦科的黄瓜[12-13]、甜瓜[14-15]、西瓜[16-17]等园艺作物上已有大量研究成果积累，而冬瓜却未见报道。因此，开展冬瓜糖代谢规律研究，对认识冬瓜果实中糖的来源、代谢进程变化特征等具有重要意义。

本研究在总结黑皮冬瓜果实生长发育规律的基础上，对不同时期的主要可溶性糖及相关酶活性进行测定，探究冬瓜果实品质形成和糖代谢动态变化规律，旨在为后期根据果实发育规律特征制定合理的冬瓜田间管理调控措施提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验时间、地点和材料

试验于2020—2021 年在广东省广州市天河区农业科学院蔬菜研究所重点实验室基地(23.16°N，113.37°E)进行。供试材料为广东省科农蔬菜种业有限责任公司提供的‘铁柱二号’黑皮冬瓜。待幼苗三叶一心期移栽到田间，种植密度为6750 株/hm2，株距60 cm，行距150 cm。种植期间，化肥用量为N 350 kg/hm2、P2O5180 kg/hm2、K2O 375 kg/hm2、MgO 90 kg/hm2，农艺管理按照当地常规管理方式。

1.2 指标测定方法

1.2.1 果实横纵径测量方法从花后5 d开始，选择8个长势均匀的冬瓜进行标记，每隔5 d 用皮尺测定果实上、中、下部位的横径、纵径和果实质量，计算果形指数。测量位点如图1所示，果形指数计算方法如式(1)。

图1 冬瓜果实发育横纵径动态测量位点

1.2.2 取样方法分别在花后5 d（幼果期）、15 d（初果期）、25 d（果实膨大期）和35 d（果实成熟期）4 个时期取样，每个时期取样8个果实。如图2所示，按照与果柄距离的近远将果实分为上、中、下3 个部位，每个部位的纵径都限制为4 cm。去除果实内的种子，用排水法测定其上、中、下部位的体积以及果实其他部位的体积，并记录。将果肉切成小块，用FAA固定液固定，用于石蜡切片分析。采集的样品立即用液氮处理后存放于-80℃，用于可溶性糖、糖代谢相关酶等指标测定。

图2 冬瓜果实取样位点

1.2.3 石蜡切片取样及制作方法将各部位果肉组织切成5 mm×5 mm×2 mm小块，放入装有FAA固定液的试管中。将试管内的空气抽尽，使材料沉底，静置固定24 h后，将组织从固定液中取出，在通风橱内将目的部位组织修平整，然后依次进行脱水、浸蜡、包埋、切片、染色和封片[18]。

用NI/E 智能生物显微镜（日本产）对所制切片进行观察并拍照保存。果肉细胞体积和细胞数目的计算参考田嘉等[19]和王燕等[20]的方法，将果肉细胞近似看成椭圆体，细胞体积的计算如式(2)。细胞数目的计算如式(3)。

式中，a为细胞长直径；b为细胞短直径；V2是果肉体积，果肉体积采用排水法测定，果肉的总体积等于各部位体积之和；Vc是细胞体积。

1.2.4 可溶性糖测定称取0.5 g 样品置于10 mL 离心管中，加入5 mL 80%乙醇溶液，80℃水浴30 min，期间混匀2 次，以便充分提取。室温下4000 r/min 离心10 min，收集上清液。用离心冷冻浓缩仪将溶液蒸干，糖析出，加入1 mL 超纯水溶解，反复冲洗，0.22µm 针式过滤器过滤，HPLC检测。采用高效液相色谱-蒸发光散射检测法（HPLC-ELSD 法）测定，检测仪器是Aglient液相色谱仪。

1.2.5 酶活性测定冬瓜果肉中α-半乳糖苷酶、蔗糖合成酶、蔗糖磷酸合成酶、可溶性酸性转化酶、细胞壁不溶性转化酶、中性转化酶、蔗糖合成酶分解方向酶活性均利用试剂盒（上海优选生物科技有限公司）进行测定。

1.2.6 数据统计分析采用SPSS 22.0进行统计分析，用Duncan 法检验不同时期以及相同时期不同部位之间差异显著性(P＜0.05)，使用Excel 2019作图。

2 结果与分析

2.1 冬瓜果实生长发育规律

冬瓜果实的上部纵径和下部纵径均遵循“S”形生长曲线，花后5～10 d冬瓜果实上部纵径的生长速率大于下部，此后，果实的上部纵径均显著大于下部纵径。果实纵径生长速率最快的时期是花后10～25 d，上部纵径、下部纵径的生长速率分别为2.05、2.06 cm/d（图3a）。冬瓜果实的上部横径、中部横径和下部横径均遵循“S”形生长曲线，上、中、下横径生长速率最快的时期均在花后10～20 d，上、中、下横径的生长速率分别为0.94、0.74、0.96 cm/d。中部横径与上部和下部相比处于生长的弱势区域。花后20～25 d，果实上部和下部横径显著大于中部横径（图3b）。总体来说，冬瓜果实整个生育期的果形指数呈现先上升再下降的变化趋势，这是由于冬瓜果实前期主要进行纵向生长，后期主要进行横向生长。整个生育期冬瓜的果形指数介于4.90～6.30之间（图3c）。冬瓜果实单果重也呈现“S”形生长规律，单果重增长最快的时期是花后15～30 d，此时冬瓜的单果重增长速率为0.70 kg/d（图3d）。

图3 冬瓜果实横纵径、果形指数和单果重的变化

2.2 冬瓜果实细胞体积和数量变化规律

如图4 所示，从花后5～35 d，在同样大的面积内，冬瓜果实的上、中、下部位果肉细胞的数目逐渐减少，细胞面积逐渐增大。花后5 d 和15 d，冬瓜果肉细胞排列紧密整齐，细胞间隙小；花后25 d，细胞之间存在间隙，细胞大小不均一。在同样大的面积内，中部的细胞数目多于上部和下部，细胞面积小于上部和下部。花后35 d，冬瓜果肉细胞变大，且薄壁细胞之间间隙较大。

图4 冬瓜果肉细胞横切图

如图5 所示，冬瓜果实的细胞数量从花后5 d 到15 d增长了2.42倍，花后15 d到25 d增长了1.28倍，花后25 d到35 d增长了1.03倍。另外，在冬瓜果实整个发育期，果肉细胞体积一直在膨大，并在花后35 d 达到最大值，与花后5 d 相比细胞体积扩大了7.02 倍。同一时期果实不同部位的细胞数目没有差异，而细胞体积在花后15 d 和25 d 时存在差异，均表现为上部=下部＞中部。

图5 冬瓜果实细胞数目和大小的变化

综上所述，冬瓜果实生长前期以细胞分裂为主，后期以细胞膨大为主。在同一时期不同部位的细胞数目无显著差异，细胞体积在花后15～25 d 在不同部位间存在差异。冬瓜果实上、中和下部横径不同主要是由细胞体积在空间上存在差异所造成的。

2.3 冬瓜果实不同部位可溶性总糖、果糖和葡萄糖浓度变化

对整个生育期冬瓜果实中多种可溶性糖进行测定，发现可溶性糖的浓度表现为果糖＞葡萄糖＞水苏糖＞棉籽糖，可能由于蔗糖浓度较低，在冬瓜果实发育的各时期均未检测出蔗糖。随着果实的生长发育，各部位的可溶性总糖、果糖、葡萄糖的浓度逐渐增加，在花后35 d达到最大值，可溶性总糖、果糖和葡萄糖物质在不同部位间无显著差异（图6）。

图6 冬瓜果实中不同部位可溶性总糖、果糖、葡萄糖浓度变化

2.4 冬瓜果实内糖类物质代谢相关酶活性变化

对冬瓜果实内糖类物质代谢相关酶活性进行测定，发现冬瓜果实中酶的活性表现为可溶性酸性转化酶＞中性转化酶＞蔗糖磷酸合成酶＞蔗糖合成酶分解方向＞蔗糖合成酶＞细胞壁不溶性转化酶（图7）。随着果实的生长发育，α-半乳糖苷酶活性逐渐降低（图7c），蔗糖合成方向酶的总活性逐渐升高（图7a），蔗糖分解方向酶的总活性逐渐降低（图7b），各个时期蔗糖分解方向酶的活性均大于蔗糖合成方向。

图7 冬瓜果实中糖类代谢相关酶活性的变化

2.5 冬瓜果实内不同部位α-半乳糖苷酶活性变化

如图8所示，随着果实的生长发育，冬瓜果实不同部位的α-半乳糖苷酶活性逐渐降低。花后25 d，冬瓜果实的α-半乳糖苷酶活性在空间上存在差异，表现为上部=中部＞下部，其他时期的α-半乳糖苷酶活性在不同部位之间无显著差异。

图8 冬瓜果实不同部位的α-半乳糖苷酶活性变化

2.6 冬瓜果实内不同部位蔗糖分解相关酶活性变化

如图9所示，随着果实的生长发育，冬瓜果实中的细胞壁不溶性转化酶和可溶性酸性转化酶的活性逐渐降低，中性转化酶和蔗糖合成酶分解方向的活性逐渐增加。细胞壁不溶性转化酶活性在花后35 d时存在部位之间的差异，为上部＞中部；中性转化酶活性在花后25和35 d时均存在部位之间的差异，分别表现为下部＞上部和上部=中部＞下部。可溶性酸性转化酶活性在同一时期各部位之间没有显著差异。考虑到在纵向上不同部位的糖类代谢酶活性无显著差异，只检测了果实中部蔗糖合成酶分解方向的酶活，结果表明该酶的活性随着果实发育逐渐升高（图9d）。

图9 冬瓜果实不同部位的蔗糖分解类酶活性变化

2.7 冬瓜果实内不同部位蔗糖合成相关酶活性变化

如图10 所示，随着果实的生长发育，冬瓜果实中蔗糖合成酶的活性变化不大，蔗糖磷酸合成酶的活性逐渐增加。蔗糖合成酶的活性在同一时期不同部位之间没有显著差异，蔗糖磷酸合成酶的活性在花后35 d存在差异，表现为上部＝下部＞中部，其他时期不同部位之间没有显著差异。

图10 冬瓜果实不同部位的蔗糖合成类酶活性变化

3 结论

冬瓜果实的横、纵径生长发育均遵循“S”形生长曲线，果实上部纵径的生长速率大于果实下部纵径，花后20～25 d时上部和下部横径的生长速率大于中部横径，而中部横径的生长对其果形品质至关重要，所以花后20～25 d时应加强田间管理。冬瓜果实发育前期以细胞分裂为主，后期以细胞膨大为主。冬瓜果实糖类物质积累的关键时期是在花后25～35 d。从冬瓜的品质和经济效益考虑，建议花后35 d左右及时采收。

4 讨论

果实的形状和大小作为最直接的外观品质性状，是消费者选择瓜果蔬菜的重要因素，也是果蔬市场分类和果实加工过程中分级的重要指标[21]。果实的形状、大小和生长发育规律是与外观品质密切相关的重要数量性状[22-25]。葫芦科拥有许多重要的水果蔬菜（瓜类），如黄瓜、甜瓜、西瓜、冬瓜和南瓜，以及各种葫芦。瓜类最具特色的是其不同的果实大小和形状[26]。早期研究表明，瓜类果实的大小和形状很大一部分是在开花前决定的[27]。前人在研究中发现，细胞数目和细胞大小共同决定果实的大小和形状，细胞数目是基础，细胞大小是关键[28]。本试验通过对冬瓜果实不同时期的解剖观察发现，冬瓜果实的细胞分裂和膨大是冬瓜果实膨大的细胞学基础，花后5～15 d即果实生长发育的前期是以细胞分裂为主；花后15～35 d 即果实发育中后期细胞分裂逐步停止，细胞膨大起主导作用，这和黄瓜、瓠瓜、番茄等果实发育的研究结果一致[29-31]。冬瓜果实上部和下部的横径生长优先于中部，冬瓜果实的中部横径对其果实的外形品质十分重要，直接影响其商品价值，因此，在花后20～25 d要加强对冬瓜的田间管理。

冬瓜等葫芦科作物是棉子糖家族寡糖运转型植物(RFOs)，其光合产物的主要运输形式是水苏糖，但是，目前鲜有关于冬瓜果实内水苏糖合成和分解的研究。黄瓜、甜瓜、南瓜等葫芦科作物果实的RFOs分解途径已基本明确。水苏糖经过韧皮部长距离运输后卸载的同时还会分解转化为果糖、葡萄糖和蔗糖。首先，水苏糖在α-半乳糖苷酶的催化下脱去一个半乳糖苷转化为棉籽糖，棉籽糖进一步在α-半乳糖苷酶的催化下脱去一个半乳糖苷转化为蔗糖[32]。进入蔗糖代谢途径后，中性转化酶、可溶性酸性转化酶、细胞壁不溶性转化酶、蔗糖合成酶分解方向催化蔗糖分解为果糖和葡萄糖，蔗糖合成酶催化游离果糖和葡萄糖合成蔗糖，蔗糖磷酸合成酶以果糖-6-磷酸为底物合成蔗糖[33-36]。葫芦科果实内主要的糖类代谢途径可用图11 表示。不同葫芦科作物果实中的葡萄糖、果糖和蔗糖的含量及比例存在很大差异，这与果实发育中糖分的合成、转运、代谢和积累密切相关[37]。成熟期的西瓜中蔗糖、果糖和葡萄糖之间的比例为5:3:2[38]。不同品种的南瓜中蔗糖、果糖和葡萄糖所占的比例也不相同，成熟期的中国南瓜蔗糖含量占总糖的85%，而印度南瓜葡萄糖含量占总糖的75%[39]。成熟期的甜瓜中蔗糖含量占总糖的60%左右[40]。可溶性糖组分的差异与其代谢相关酶活密切相关，蔗糖合成酶和蔗糖磷酸合成酶的活性与蔗糖积累量呈显著正相关关系[38,41]，而转化酶的活性与蔗糖积累量显著负相关[42]。本研究发现，冬瓜果实中最主要的糖类物质是果糖和葡萄糖，分别占可溶性总糖的51%和48%，蔗糖、水苏糖和棉籽糖的浓度很低，甚至在某些时期和部位检测不出来，这和黄瓜中不同种类可溶性糖所占比例结果相似[13,43]。随着果实的生长发育冬瓜果实内的果糖和葡萄糖浓度逐渐增加。蔗糖代谢相关酶的净活性等于蔗糖合成酶类的总活性减去蔗糖分解方向的总活性，当净活性为负值时，蔗糖不积累或者少量积累。本研究发现，蔗糖分解方向的总酶活远大于合成方向，因此，冬瓜果实内的蔗糖浓度极低，以至于检测不出来。冬瓜果实中糖类物质积累最快的时期是花后25～35 d，此时冬瓜果实正处于膨果期，应注重冬瓜的水肥管理。

图11 葫芦科果实主要糖类物质及其相关酶活代谢关系

本试验主要聚焦于冬瓜上、中、下部位的糖类物质以及相关酶活的研究上，研究团队前期研究发现，冬瓜的外层、中层和内层的可溶性固形物存在显著差异，为外层＞中层＞内层[44]，但是目前对冬瓜外层、中层和内层的糖类物质及酶活的动态变化规律还不清楚；此外，鲜少有关于黑皮冬瓜贮藏期品质变化的研究，下一步可以从上述2个方面着手进行探究。