靶向敲降Linc00673对胃癌细胞增殖、凋亡的影响及其机制

郭红艳 徐亚茹 李耕慧 孙晓杰 赵正林 吴琦 刘波

(齐齐哈尔医学院 1生化教研室,黑龙江 齐齐哈尔 161006;2附属第一医院检验科;3齐齐哈尔市第一医院老年科;齐齐哈尔医学院 4临床生化教研室;5附属第二医院办公室)

目前,胃癌占我国消化道肿瘤的第一位,对身体健康危害严重,且在我国的发病率呈逐年递增的趋势。近年来多项研究结果显示,长链非编码RNA(LncRNA)与胃癌的发生、发展密切相关〔1～3〕。Linc00673是2015年被鉴定的胰腺癌易感基因,参与非小细胞肺癌、肝癌、直肠癌和乳腺癌等多种肿瘤的侵袭转移,在胃癌组织中的表达与该病的淋巴转移、远处转移和TNM分期相关〔4〕,但其在胃癌中的生物学作用尚不完全清楚,对其作用机制也鲜有报道。本研究构建靶向敲降Linc00673重组慢病毒载体,并将其转染至胃癌MGC-803细胞系,观察Linc00673敲降后胃癌细胞增殖和凋亡等生物学行为的变化,并探讨其作用的分子机制。

1 材料与方法

1.1主要材料与试剂 肾上皮细胞293T、胃癌细胞系MGC-803由本课题组冻存,慢病毒重组质粒Linc00673-sh1～3由上海捷瑞生物工程有限公司构建并测序鉴定,对照空载体质粒PSIH1和慢病毒包装质粒pMD2.G、psPAX2由中国医学科学院肿瘤医院黄常志教授惠赠;DMEM、胎牛血清(FBS)和胰酶购自Gibco公司;嘌呤霉素、噻唑蓝(MTT)和碘化丙啶(PI)购自Sigma-Aldrich公司;qPCR试剂盒购自Yeasen生物公司;细胞凋亡检测试剂盒为北京四正柏公司产品;蛋白提取和含量测定试剂盒购自Beyotime生物公司,所用抗体均为Cst公司产品。

1.2方法

1.2.1qPCR检测Linc00673敲降效率 分别用Linc00673-sh1～3慢病毒和对照空载体PSIH1慢病毒感染常规培养的MGC-803细胞,继续培养48 h后用2 μg/ml嘌呤霉素筛选,获得对照空载体和靶向敲降Linc00673的胃癌细胞系,0.25%的胰酶消化收集各组细胞,提取总RNA,逆转录后进行实时荧光定量PCR反应,检测上述细胞系中Linc00673的表达(设GAPDH为内参)。引物由Invitrogen公司合成,Linc00673上游引物CTGCTCTTTGGCCTTGGATG,下游:ACGGATGGAGAAGAGGTCG-T;GAPDH上游引物:CCTGGTATGACA-ACGAATTTG,下游:CAGTGAGGGTCTCTCTCTTCC。反应条件:95 ℃预变性30 s;95 ℃变性10 s,60 ℃退火及延伸30 s,40次循环,3个复孔/样品,2-ΔΔCt计算基因的相对表达量。

1.2.2MTT法检测细胞增殖 将转染Linc00673-sh1和PSIH1的MGC-803细胞分别接种于96孔板,每组6个复孔,每孔103个细胞,37 ℃、5%CO2、含10%FBS 的DMEM培养基常规培养,连续5 d,每24 h取一块96孔板,弃培养液并用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗,加入110 μl MTT染液培养4 h,吸去上清液,每孔中加150 μl二甲基亚砜(DMSO),测定492 nm吸光度值,绘制细胞生长曲线。

1.2.3克隆形成实验 分别将Linc00673-sh1和PSIH1组细胞制成单细胞悬液后进行细胞计数,以200个细胞/孔和500个细胞/孔将细胞分别分散均匀接种于6孔板中,常规培养3 w,经PBS清洗3次→甲醇固定→结晶紫染色,显微镜下进拍照并对细胞集落计数。

1.2.4细胞周期与凋亡检测 Linc00673-sh1和PSIH1组细胞培养48 h,胰酶消化收集细胞,PBS洗3次,按试剂盒说明书操作,膜联蛋白Ⅴ-异硫氰酸荧光素(Annexin V-FITC)/PI双染检测细胞凋亡,PI单染检测细胞周期(BD FACSCalibur流式细胞仪,USA),细胞凋亡结果用CellQuest软件分析,ModFit软件分析细胞周期。

1.2.5qPCR检测相关调控因子及microRNA表达 将细胞用胰酶消化收集后提取总RNA,荧光定量PCR试剂盒检测细胞E-钙黏蛋白(E-cadherin)、基质金属蛋白酶(MMP)7、p19基因及miR-1254、miR-4491的表达水平,mRNA检测以GAPDH为内参,microRNA检测以U6为内参(试剂盒自带),反应条件同前,各基因引物序列如下:E-cadherin上游引物:5′-CGAGAGCTACACGTTCACGG-3′、下游:5′-GGGTGTCGAGGGAAAAATAGG-3′,p19上游引物:5′-AACCGCTTCGGCAAGAC-3′、下游:5′-ACTGGA-CTGGTACCGGAGGT-3′,MMP7上游引物:5′-AGTGGTCACCTACAGGATCG-3′、下游:5′-GGGATCTCTT-TGCCCCACAT-3′,GAPDH上游引物:5′-CCTGGTATGACAACGAATTTG-3′、下游:5′-CAGTGAGGGTC-TCTCTCTTCC-3′,miR-1254上游引物:5′-AGCCTGGAAGCTGGAGCCTG-3′,miR-4491上游引物:5′-AATGTGGACTGGTGTGACCAAA-3′。

1.2.6Western印迹实验 提取Linc00673-sh1和PSIH1组细胞总蛋白,测定蛋白浓度,蛋白样品进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)并转膜,5%脱脂奶粉常温封闭2 h,TBST洗聚偏氟乙烯(PVDF)膜后用1∶1 000稀释的一抗〔B细胞淋巴瘤基因(Bcl)-2、磷酸化-蛋白激酶B(p-Akt)、核因子(NF)-κB、Zeste增强子同源物(EZH)2、β-catenin和GAPDH〕4 ℃孵育过夜,加二抗(1∶5 000)37 ℃孵育1 h,电化学发光(ECL)显色,凝胶成像处理系统成像。

1.3统计学处理 采用SPSS21.0软件进行Dunnett-t检验和Studentt检验。

2 结 果

2.1实时荧光定量PCR方法鉴定MGC-803细胞中Linc00673的表达 将重组慢病毒转染MGC-803细胞后,Linc00673-sh1、Linc00673-sh2、Linc00673-sh3组细胞Linc00673相对表达量(0.297±0.021、0.306±0.008、0.403±0.010)均明显低于PSIH1组(1.008±0.153,均P<0.01),其中Linc00673-sh1敲降效果最为显著。

2.2Linc00673敲降抑制MGC-803细胞生长 与PSIH1组相比,Linc00673-sh1组细胞增殖速度减慢,细胞生长的第2～5天,Linc00673-sh1组A492均明显低于PSIH1组(P<0.01)。见表1。

表1 各组细胞生长A492比较

2.3Linc00673敲降抑制MGC-803细胞克隆增殖 在孔板中分别接种200和500个细胞/孔,培养21 d后可见,转染Linc00673-sh1组的胃癌细胞集落数量明显少于PSIH1组(P<0.05,P<0.01)。见表2、图1。

图1 靶向敲降Linc00673抑制细胞增殖(结晶紫染色)

表2 各组细胞集落形成数比较

2.4靶向敲降Linc00673对MGC-803细胞周期的影响 靶向敲降Linc00673后的MGC-803细胞较PSIH1组细胞G0/G1期、S期比例无明显变化,而G2/M期细胞占比明显高于PSIH1组(P<0.01)。见表3。

表3 Linc00673敲降对MGC-803细胞周期的影响

2.5Linc00673敲降对相关调控因子及microRNA表达的影响 Linc00673敲降后较PSIH1组细胞E-cadherin和p19表达量均明显增加、MMP7表达明显降低,而miR-1254和miR-4491表达量明显增加(P<0.05,P<0.01)。见表4。

表4 Linc00673敲降对MGC-803细胞相关调节因子、microRNA表达、细胞增殖相关蛋白及PI3K/Akt信号通路关键因子的影响

2.6Linc00673敲降影响细胞增殖与凋亡的机制 Linc00673敲降后的胃癌细胞中PI3K/Akt信号通路相关因子p-Akt、NF-κB和Bcl-2及增殖相关蛋白β-catenin和EZH2表达较PSIH1组明显降低(P<0.01,P<0.001)。见表4、图2。

图2 Western印迹检测各组细胞增殖相关蛋白及PI3K/Akt信号通路关键因子

2.7Linc00673敲降对MGC-803细胞凋亡的影响 PSIH1组细胞晚期凋亡(UR)率和总凋亡(LR+UR)率分别为(7.34±0.76)%和(9.93±0.70)%,而Linc00673-sh1组明显增加〔(14.39±1.83)%和(15.74±2.06)%,P<0.01〕。见图3。

图3 流式细胞术检测胃癌MGC-803细胞凋亡

3 讨 论

胃癌是发病率和死亡率均较高的一种恶性肿瘤,早发现、早治疗对降低该病死亡率十分重要〔5〕,尽管近年来胃癌的诊断和治疗方面有了显著的改善,但目前仍缺乏有效的诊断生物标志物。因此,阐明胃癌的分子机制、提高该病诊断水平并有针对性的分子治疗十分必要。

Linc00673定位于人染色体17q24.3,其序列包含一个与类固醇受体RNA激活剂(SRA)1非常相似的保守区域,因此也被称为“SRA样非编码RNA”(SLNCR)Linc00673被鉴定在包括GC在内的多种恶性肿瘤的发生中起作用〔6～8〕,其表达与癌症患者临床预后的关系表明,其表达水平可作为一个潜在的预后指标。本研究结果可见,Linc00673敲降对GC的发展起到一定的抑制作用。

越来越多的研究表明,LncRNA 是细胞内信号通路的重要介质,也是调控基因表达的重要分子,参与调节mRNA的稳定和转运及microRNA的海绵作用〔9,10〕。LncRNA 与microRNA相互作用调控基因表达是其发挥作用的主要途径。

本研究结果显示,靶向敲降Linc00673后胃癌细胞中PI3K下游分子p-Akt及分别具有促进增殖和抑制凋亡作用的NF-κB、Bcl-2表达均降低,这些基因表达的改变影响PI3K/Akt信号通路活性,从而促进细胞凋亡抑制细胞增殖。因此,Linc00673敲降后通过调节PI3K/Akt信号通路对MGC-803细胞生物学行为产生的一系列影响有可能是其发挥作用的机制之一。

此外,靶向敲降Linc00673后,细胞增殖相关蛋白β-catenin和EZH2的表达量也有所降低,而前者参与Wnt信号通路,众所周知,细胞信号传导网络交错复杂,有研究者提出〔11〕,Linc00673还参与SRC-EPK、Wnt、p53和EMT相关信号通路观点,Linc00673作为一种新发现的非编码RNA,其上游调控和下游信号转导的确切机制有待系统研究和深入研究,以促进其临床应用。

尽管目前已经明确Linc00673参与了肿瘤进程的调控,但其是否参与其他疾病的发病,其发挥作用是否与外泌体相关?目前还没有研究者对这些问题进行研究探讨,其是否可以作为胃癌的诊断、治疗、预后甚至是治疗的分子靶标仍有待进一步研究。