lncRNA GATA3-AS1通过靶向miR-361-3p调控T细胞淋巴瘤细胞增殖、迁移和侵袭

王璐 董荣荣 孙士营 王玉萍

(1山东大学齐鲁医院(青岛)皮肤科,山东 青岛 266035;2青岛市妇女儿童医院检验科;3山东大学齐鲁医院(青岛)检验医学中心)

淋巴瘤根据形态和免疫组化可将其分为霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤。非霍奇金淋巴瘤来源于B、T和自然杀伤NK淋巴细胞,包括懒惰型和侵袭型〔1〕。T细胞淋巴瘤是一种侵袭性恶性肿瘤,占非霍奇金淋巴瘤的12%～15%,多发生于中老年人。目前,由于T细胞淋巴瘤的化疗药物敏感性低、复发率高等不利因素,患者的治疗效果和预后仍不理想〔2〕。因此,亟待寻找有效的治疗手段。长非编码RNA(lncRNAs)是指长度超过200个核苷酸且不具有编码蛋白功能的转录本,研究发现,lncRNAs与人类多种恶性肿瘤进展密切相关。lncRNA GATA结合蛋白3反义RNA(GATA3-AS)1首次发现于人类CD4+T细胞亚群〔3〕。lncRNA GATA3-AS1在三阴性乳腺癌组织和细胞中高表达,敲除lncRNA GATA3-AS1可抑制三阴性乳腺癌细胞生长,并增强免疫应答的抵抗力,lncRNA GATA3-AS1通过稳定程序性细胞死亡-配体(PD-L)1蛋白和降解GATA3蛋白来促进三阴性乳腺癌进展和免疫逃〔4〕。lncRNA GATA3-AS1在肝癌中高表达与肿瘤大小、分期、转移及患者总生存期缩短显著相关,lncRNA GATA3-AS1通过抑制磷酸酯酶与张力蛋白同源物(PTEN)、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂(CDKN)1A和TP53表达促进肝癌细胞增殖和转移〔5〕。在胰腺癌组织和细胞中,lncRNA GATA3-AS1表达上调,敲除lncRNA GATA3-AS1通过miR-30b-5p/Tex10轴抑制胰腺癌细胞的增殖、侵袭和致瘤能力,并促进细胞凋亡〔6〕。然而lncRNA GATA3-AS1在淋巴瘤中的表达及作用尚不清楚,本实验通过StarBase预测发现lncRNA GATA3-AS1与miR-361-3p具有结合位点。研究报道,miR-361-3p在淋巴瘤细胞中表达下调,过表达miR-361-3p通过Wnt/β-Catenin信号通路抑制细胞的增殖和迁移,促进凋亡〔7〕。尽管miR-361-3p在淋巴瘤中的作用已有报道,但lncRNA GATA3-AS1在淋巴瘤中的作用及其分子机制是否与miR-361-3p有关还尚未可知。本文对LncRNA GATA-AS1通过靶向miR-361-3p调控T细胞淋巴瘤细胞的增殖、迁移和侵袭展开研究。

1 材料与方法

1.1临床资料 选取山东大学齐鲁医院2017年6月至2019年6月收治并手术切除的30例T细胞淋巴瘤组织及其癌旁组织样本,并保存于-80 ℃冰箱,患者均知情同意,本研究经医院伦理委员会批准。

1.2细胞与试剂 人T淋巴细胞H9和T细胞淋巴瘤细胞Jurkat、人急性淋巴细胞白血病T淋巴细胞(CCRF-CEM)和人淋巴母细胞淋巴瘤细胞(SUP-T1)购自中国典型培养物保藏中心;胎牛血清、RPMI1640培养基购自美国Gibco公司;Trizol试剂、qRT-聚合酶链反应(PCR)、反转录试剂盒购自北京天根生化科技有限公司;四甲基偶氮唑蓝(MTT)试剂盒购自上海晶抗生物工程有限公司;Transwell小室购于美国密理博公司;放射免疫沉淀(RIPA)蛋白裂解液、二辛可宁酸(BCA)、双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自北京百奥莱博科技有限公司;Lipofectamine2000购自美国Invitrogen公司;si-NC、si-GATA3-AS1、miR-NC、miR-361-3p、anti-miR-NC、anti-miR-361-3p购自上海吉玛制药公司;pcDNA、pcDNA-GATA3-AS1购自上海索宝生物科技有限公司。

1.3细胞转染与分组 将si-NC、si-GATA3-AS1、miR-NC、miR-361-3p分别转染至Jurkat细胞,记为si-NC组、si-GATA3-AS1组、miR-NC组、miR-361-3p组;共转染si-GATA3-AS1和anti-miR-NC、si-GATA3-AS1和anti-miR-361-3p至Jurkat细胞,记为si-GATA3-AS1+anti-miR-NC组、si-GATA3-AS1+anti-miR-361-3p组。

1.4RT-qPCR 提取细胞总RNA,反转录成cDNA,lncRNA GATA3-AS1、miR-361-3p分别以磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)和U6为内参,相对表达量采用2-△△Ct法计算。lncRNA GATA3-AS1上游引物:5′-AAGTTGAGCGGGGTATGT-3′,下游:5′-TTTCTGGCCTTTGGTGTC-3′;miR-361-3p上游引物:5′-CTGCACTCCCCCACCTG-3′,下游:5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′;GAPDH上游引物:5′-AGAACGGGAAGCTTGTCATC-3′,下游:5′-CATCGCCCCACTTGATTTTG-3′;U6上游引物:5′-TGCGGGTGCTCGCTTCGGCAGC-3′,下游:5′-CCAGTGCAGGGTCCGAGGT-3′。引物由上海生工生物工程公司合成。

1.5MTT 将各组Jurkat细胞以2.5×104个/ml接种于96孔板(100 μl/孔),培养48 h后,加入20 μl/孔MTT,培养4 h,弃上清,加入150 μl/孔二甲基亚砜(DMSO),室温震荡孵育5 min,酶标仪检测450 nm处的光密度(OD)值。

1.6Transwell 将各组Jurkat细胞接种于Transwell小室上室(5×104个/孔),下室加入含10%胎牛血清的600 μl培养液,在37 ℃下孵育24 h后,用棉签擦去未穿膜的细胞。多聚甲醛固定,0.1%结晶紫染液染色。置于显微镜下计数。

1.7Western印迹提取各组细胞总蛋白,BCA试剂盒定量。各组上样量60 μg,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)后转至聚偏氟乙烯(PVDF)上,5%脱脂牛奶封闭,一抗4 ℃孵育过夜,加入二抗孵育2 h,显影,定影,Image J软件分析目的蛋白的相对表达量。

1.8统计学处理 采用SPSS21.0软件进行独立样本t检验、单因素方差分析。

2 结 果

2.1lncRNA GATA3-AS1和miR-361-3p在T细胞淋巴瘤组织中的表达 与癌旁组织比较,T细胞淋巴瘤组织lncRNA GATA3-AS1表达水平(1.00±0.16 vs 4.15±0.52)显著升高,miR-361-3p表达水平显著降低(1.00±0.12 vs 0.49±0.06,P<0.05);与人T淋巴细胞H9组比较,T细胞淋巴瘤细胞Jurkat、CCRF-CEM和SUP-T1组中lncRNA GATA3-AS1表达水平显著升高,miR-361-3p组表达水平显著降低(P<0.05)。见表1。

表1 lncRNA GATA3-AS1和miR-361-3p在T细胞淋巴瘤细胞中的表达

2.2干扰lncRNA GATA3-AS1表达对T细胞淋巴瘤Jurkat细胞增殖、迁移和侵袭的影响 与si-NC组比较,si-GATA3-AS1组OD值、迁移、侵袭细胞数及GATA3-AS1、细胞周期蛋白(Cyclin)D1、基质金属蛋白酶(MMP)-2、MMP-9表达水平显著降低,p21表达水平显著升高(P<0.05)。见表2、图1、图2。

1～6:si-NC组、si-GATA3-AS1组、miR-NC组、miR-361-3p组、si-GATA3-AS1+anti-miR-NC组、si-GATA3-AS1+anti-miR-361-3p组,下图同图1 各组T细胞淋巴瘤Jurkat细胞迁移和侵袭(结晶紫染色,×200)

图2 各组T细胞淋巴瘤Jurkat细胞增殖、迁移和侵袭相关蛋白表达

表2 干扰lncRNA GATA3-AS1表达对T细胞淋巴瘤Jurkat细胞增殖、迁移和侵袭的影响

2.3lncRNA GATA3-AS1靶向调控miR-361-3p表达 StarBase预测显示lncRNA GATA3-AS1序列含有与miR-361-3p互补的核苷酸序列。见图3。与转染miR-NC的WT-GATA3-AS1比较,转染miR-361-3p荧光素酶活性显著降低(P<0.05)。与pcDNA组miR-361-3p表达(1.01±0.12)比较,pcDNA-GATA3-AS1组(0.42±0.03)显著降低(P<0.05);与si-NC组miR-361-3p表达(1.00±0.08)比较,si-GATA3-AS1组(2.93±0.39)显著升高(P<0.05)。lncRNA GATA3-AS1靶向负调控miR-361-3p表达(P<0.05)。见图1、表3。

图3 GATA3-AS1与miR-361-3p的互补核苷酸序列

表3 双荧光素酶报告实验

2.4过表达miR-361-3p对T细胞淋巴瘤Jurkat细胞增殖、迁移和侵袭的影响 与miR-NC组比较,miR-361-3p组miR-361-3p及p21表达显著升高,OD值、迁移、侵袭细胞数及CyclinD1、MMP-2、MMP-9表达显著降低(均P<0.05)。见图1、图2、表4。

表4 过表达miR-361-3p对T细胞淋巴瘤Jurkat细胞增殖、迁移和侵袭的影响

2.5下调miR-361-3p逆转干扰lncRNA GATA3-AS1表达对T细胞淋巴瘤Jurkat细胞增殖、迁移和侵袭的影响 与si-GATA3-AS1+anti-miR-NC组比较,si-GATA3-AS1+anti-miR-361-3p组miR-361-3p及p21表达水平显著降低,OD值、迁移、侵袭细胞数及CyclinD1、MMP-2、MMP-9表达水平显著升高(P<0.05)。见图1、图2、表5。

表5 下调miR-361-3p逆转干扰lncRNA GATA3-AS1表达对T细胞淋巴瘤Jurkat细胞增殖、迁移和侵袭的影响

3 讨 论

lncRNAs的异常表达与淋巴瘤的发生和发展密切相关。在体内外实验中,过表达lncRNA TCLlnc1促进T细胞淋巴瘤细胞的增殖和迁移〔8〕。LINC01013在间变性大细胞淋巴瘤组织中表达上调,敲除LINC01013抑制侵袭性间变性大细胞淋巴瘤细胞的侵袭〔9〕。在结外自然杀伤/T细胞淋巴瘤组织和细胞中,lncRNA XIST表达显著增加,敲除lncRNA XIST通过miR-497/B细胞淋巴瘤(Bcl)-w轴抑制结外自然杀伤/T细胞淋巴瘤细胞的增殖和迁移〔10〕。在弥漫性大B细胞淋巴瘤组织中,lncRNA MALAT1表达上调,敲减lncRNA MALAT1通过miR-195/PD-L1轴抑制OCI-Ly10细胞增殖、迁移、上皮间质转化(EMT)和免疫逃逸能力,并促进细胞凋亡〔11〕。LINC00908在弥漫性大B细胞淋巴瘤组织和细胞中表达显著上调,下调LINC00908通过靶向上调miR-671-5p抑制弥漫性大B细胞淋巴瘤细胞的增殖和侵袭〔12〕。lncRNA PCAT1在弥漫性大B细胞淋巴瘤组织和细胞系中表达上调,其高表达与患者的临床分期及淋巴瘤国际预后评分(IPI)评分有关,lncRNA PCAT1通过miR-508-3p/核因子(NF)IB轴促进弥漫性大B细胞淋巴瘤细胞的增殖、迁移和侵袭〔13〕。与上述研究结果一致,本实验结果提示,干扰lncRNA GATA3-AS1表达可降低Jurkat细胞的增殖、迁移和侵袭能力。

研究表明,lncRNAs可作为竞争性内源RNA负调控相关miRNA表达来调节淋巴癌进展〔10～13〕。miR-361-3p在人类多种癌症中发挥抑癌基因作用,如miR-361-3p在骨髓瘤细胞中低表达,上调miR-361-3p通过靶向肿瘤坏死因子受体相关因子(TRAF)6诱导骨髓瘤细胞凋亡,并抑制细胞增殖〔14〕。miR-361-3p在复发性前列腺癌患者中低表达,过表达miR-361-3p可通过抑制ARv7和MAP激酶结合丝氨酸/苏氨酸激酶(MKNK)2表达提高前列腺癌细胞的恩扎鲁胺敏感性〔15〕。在宫颈癌组织和细胞中,CircUBAP2 表达上调,下调miR-361-3p可部分逆转敲减CircUBAP2表达对宫颈癌细胞生长和转移的抑制作用〔16〕。circ_0075960通过调控miR-361-3p/SH2B1轴促进子宫内膜癌进展〔17〕。敲减circ_0011385通过上调miR-361-3p抑制甲状腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭,并促进细胞周期阻滞和凋亡〔18〕。miR-361-3p在非小细胞肺癌组织和细胞中表达显著降低,其低表达与淋巴结转移和TNM分期密切相关,抑制miR-361-3p表达通过靶向上调SH2B1促进非小细胞肺癌细胞的生长、增殖、集落形成、侵袭和迁移〔19〕。与上述研究结果一致,本实验结果提示,过表达miR-361-3p可降低Jurkat细胞的增殖、迁移和侵袭能力,且下调miR-361-3p逆转了干扰lncRNA GATA3-AS1表达对Jurkat细胞增殖、迁移和侵袭的影响。