芍药苷调控RhoA/ROCK2通路对阿尔茨海默病大鼠认知功能障碍的影响

王柳青 鲁建华 肖骋 陈梦宇 谢丁玲

(咸宁市中心医院神经内科,湖北 咸宁 437000)

阿尔茨海默病(AD)是一种发生于老年人群的中枢神经系统退行性疾病,患者脑组织结构和功能随年龄增长而发生衰老和退化,可严重损害患者学习认知能力,极大降低其生活质量,给家庭和社会均带来很大负担〔1～4〕。AD的发病机制复杂,补体系统、氧化应激、溶酶体和炎症等多种物质及病理反应涉及其中,研究发现,清除活性氧(ROS),抑制淀粉样斑块引发的小胶质细胞激活,可减轻脑组织神经炎症和氧化应激损伤,改善AD神经功能减退症状〔5,6〕。Ras同源基因家族成员(Rho)A/Rho相关的卷曲螺旋激酶(ROCK)2信号通路在AD的发病及病情进展中起到重要的调控作用,阻滞其信号途径传导,可对抗炎症反应,增强抗氧化活性,降低氧化应激水平,减轻AD大鼠海马神经元损伤,最终改善其认知功能障碍症状〔7,8〕。芍药苷是一种水溶性单萜苷,提取自芍药或牡丹根皮中,具有明显的抗炎、镇静、解痉、抗氧化等药理作用,可有效减轻AD动物模型β-淀粉样蛋白(Aβ)过度沉积,阻止脑组织炎症反应和氧化应激反应,减少神经元细胞凋亡,改善AD临床症状〔9,10〕,但芍药苷是否可通过调控RhoA/ROCK2通路影响AD大鼠认知功能障碍,目前尚未有详细阐述,本文通过构建AD大鼠模型,对此进行探讨。

1 材料与方法

1.1动物 SD大鼠,雄性,SPF级,13～14月龄,体质量350～365 g,购自河北医科大学动物实验中心,合格证号501628,许可证号SCXK(冀)2019-8-116。严格按照动物饲养规范于咸宁市中心医院动物中心适应饲养,温度22.5～25.5 ℃,相对湿度50%～55%,明暗光照以12 h/12 h循环交替。

1.2主要试剂及仪器 Aβ1～42多肽(A99280)购自上海吉至生化科技有限公司;芍药苷(纯度>98%,L07M9Q60533)购自上海源叶生物科技有限公司;Rhosin(HY-12646)购自美国MedChemExpress公司;苏木素-伊红(HE)染色试剂盒(E607318-0200)、二喹啉甲酸(BCA)蛋白质定量检测试剂盒(C503021-0500)、丙二醛(MDA)含量检测试剂盒(D799762-0100)、超氧化物歧化酶(SOD)活性检测试剂盒(D799593-0050)、RIPA裂解液(C500005-0050)购自上海生工生物工程股份有限公司;活性氧(ROS)测定试剂盒(E004-1-1)、白细胞介素(IL)-6测试盒(H007)、干扰素(IFN)-γ测试盒(H025)购自南京建成生物工程研究所有限公司;兔源GAPDH一抗(ab181602)、兔源RhoA抗体(ab187027)、兔源ROCK2抗体(ab125025)、羊抗兔二抗(ab150077)购自美国Abcam公司。

水迷宫视频分析系统(DB001 Morris)购自北京智鼠多宝生物科技有限责任公司;酶标仪(M200 PRO)购自瑞士TECAN公司;超薄切片机(EM UC7)购自德国Leica公司;光学显微镜(IX71)购自日本Olympus公司;大鼠脑立体定位注射仪购自日本Narishige公司;垂直电泳转印系统(1658033)购自美国Bio-Rad公司等。

1.3制备AD模型大鼠及分组给药 参照文献〔11〕中方法建立AD模型:以40 mg/kg的剂量腹腔注射进禁食12 h大鼠体内,待大鼠完全麻醉后,剃去头顶毛发,消毒后剪开暴露颅骨,以骨钻打开颅骨,通过脑立体定位仪定位海马CA1区,向其中缓慢注入2 g/L的Aβ1～42多肽溶液2 μl,留针5 min后缝合切口,7 d后通过Morris水迷宫实验检测大鼠学习记忆能力,当其明显减弱时,表明AD模型制备合格,随机分为模型组、芍药苷(20 mg/kg)组、Rhosin(RhoA抑制剂,40 mg/kg)组、芍药苷(20 mg/kg)+Rhosin(40 mg/kg)组,另外选取12只SD大鼠,以同样操作向其海马CA1区注射2 μl生理盐水作为假手术组。

以生理盐水溶解芍药苷与Rhosin配制药液,得到4 mg/ml的芍药苷药液〔12〕、8 mg/ml的Rhosin药液〔13〕、浓度分别为4、8 mg/ml的芍药苷和Rhosin混合药液,药物干预组大鼠均以5 ml/kg的剂量腹腔注射,假手术组和模型组大鼠腹腔注射等剂量生理盐水,用药1次/d,共持续用药21 d。

1.4Morris水迷宫实验 末次用药结束后24 h,参照文献〔14〕中方法进行Morris水迷宫实验,训练大鼠自水池的4个象限寻找平台,到第6天时测定大鼠逃避潜伏期,即大鼠自入水直至找到水下平台所花费时间,超过90 s仍未找到平台的大鼠,逃避潜伏期记为90 s,重复测量3次,取平均值。

1.5检测大鼠海马组织病理形态及收集标本 水迷宫实验结束后,使用乙醚气体麻醉大鼠,采用2 ml注射器吸取颈动脉血1.2 ml,转入离心管中4 ℃离心,小心吸出上清,分组标记后存在-80 ℃备用;将大鼠断头处死,剥离出大脑,每组随机选出6个大脑,分离出海马组织,转移至冻存管中,标记组别后存在液氮中备用;各组剩余的6个大脑,做清洗、固定、脱水、包埋处理后,采用切片机切为连续冠状切片,选出含有清晰海马结构的薄片,进行脱蜡、水化处理,使用试剂盒按照其说明书指导步骤进行HE染色,以蒸馏水漂洗后,转移至载玻片上封片,使用光学显微镜观察海马组织病理形态,并任意选出5个视野拍照。

1.6检测大鼠海马组织SOD、ROS、MDA水平和血清IL-6、IFN-γ含量1.5中的血清,提前取出以冰水浴解冻,采用试剂盒按照其各自说明书指导步骤测定各组IL-6、IFN-γ含量。1.5中的海马组织取出,加入RIPA裂解液,通过匀浆、离心提出总蛋白,以BCA法测出其浓度后,每组各取120 μl,采用试剂盒按照其各自说明书指导步骤测定其中SOD、ROS、MDA水平。

1.7Western印迹检测各组大鼠海马组织RhoA/ROCK2通路相关蛋白表达 取出1.6中剩余的蛋白样品液,均煮沸(100 ℃)5 min变性,通过电泳(110 V,90 min)将20 mg各组蛋白分离开,并通过湿转(400 mA,60 min)转移至硝酸纤维素膜上,然后以5%脱脂奶粉封闭其非特异位点(37.5 ℃,90 min),将RhoA、ROCK2、GAPDH 3种目的蛋白条带裁下,以对应一抗溶液孵育(4 ℃,12 min),TBST洗膜3次(5 min/次),以羊抗兔二抗溶液孵育(37.5 ℃,90 min)后,以同样操作再次洗膜,将蛋白条带显色后拍照,并采用Quantity One软件对其灰度进行定量后统计,最终得出各组蛋白相对表达。

1.8统计学分析 采用GraphPad Prism6.0软件进行单因素方差分析、LSD-t检验。

2 结 果

2.1各组认知功能 与假手术组相比,模型组逃避潜伏期明显延长(P<0.05);与模型组相比,药物干预组逃避潜伏期均显著缩短(P<0.05);与芍药苷组、Rhosin组相比,芍药苷+Rhosin组逃避潜伏期均显著缩短(P<0.05)。见表1。

表1 各组逃避潜伏期、IL-6、IFN-γ、MDA含量及SOD、ROS活性比较

2.2各组海马组织病理形态检测结果 假手术组海马组织结构完好,神经元形态及排列正常;模型组神经元细胞结构萎缩,变性死亡,排列紊乱疏松,数目明显减少,海马组织呈现明显损伤;与模型组相比,药物干预组海马组织上述病理损伤均减轻;与芍药苷组、Rhosin组相比,芍药苷+Rhosin组海马组织上述病理损伤均进一步减轻。见图1。

图1 各组海马组织神经元(HE染色,×400)

2.3各组海马组织SOD和ROS、MDA含量 与假手术组相比,模型组海马组织SOD活性显著降低(P<0.05),ROS、MDA含量明显升高(P<0.05);与模型组相比,药物干预组海马组织SOD含量明显升高,ROS、MDA含量均明显降低(P<0.05);与芍药苷组、Rhosin组相比,芍药苷+Rhosin组海马组织SOD含量明显升高,ROS、MDA含量均明显降低(P<0.05)。见表1。

2.4各组血清致炎因子IL-6和IFN-γ含量 与假手术组相比,模型组血清致炎因子IL-6和IFN-γ含量明显升高(P<0.05);与模型组相比,药物干预组血清致炎因子IL-6和IFN-γ含量均显著降低(P<0.05);与芍药苷组、Rhosin组相比,芍药苷+Rhosin组血清致炎因子IL-6和IFN-γ含量均显著降低(P<0.05)。见表1。

2.5各组海马组织RhoA/ROCK2通路相关蛋白表达水平 与假手术组相比,模型组海马组织RhoA、ROCK2蛋白表达明显升高(P<0.05);与模型组相比,药物干预组海马组织RhoA、ROCK2蛋白表达均显著降低(P<0.05);与芍药苷组、Rhosin组相比,芍药苷+Rhosin组海马组织RhoA、ROCK2蛋白表达均显著降低(P<0.05)。见图2、表2。

1～5:假手术组、模型组、芍药苷组、Rhosin组、芍药苷+Rhosin组图2 各组海马组织RhoA/ROCK2通路相关蛋白的Western印迹检测

表2 各组海马组织RhoA/ROCK2通路相关蛋白相对表达水平

3 讨 论

Aβ引发的炎症级联反应是AD发生的经典假说,证据表明,Aβ多肽可诱导脑组织发生明显的炎症和氧化应激损伤,导致Aβ大量沉积脑内形成斑块,诱导神经元凋亡丢失,损害AD模型大鼠学习记忆功能〔15,16〕。本文结果表明,Aβ1～42多肽可诱导ROS与炎性细胞因子大量合成释放,降低内源性抗氧化活性,引发强烈过氧化及炎症反应,导致海马神经元死亡缺失,造成大鼠认知功能障碍,揭示AD模型构建成功。

目前临床中常用的AD治疗药物,无法从根本上阻止疾病进展,还存在一定副作用,而中药因其安全性在AD的防治中得到越来越多的重视,芍药苷是具有明显消炎抑菌、减轻过氧化与应激反应功效的单萜苷类化合物,可有效抑制氧化应激及炎性反应,减轻脂多糖诱导的急性脑损伤,并保护脑缺血再灌注大鼠神经功能〔17,18〕,还可有效抑制Aβ斑块形成,修复神经递质正常平衡,明显改善AD记忆能力减退症状〔8〕,本文结果表明,芍药苷可提升AD大鼠抗氧化活性,减轻其脑组织炎症及过氧化损伤,改善认知功能,进一步证实了芍药苷对AD的疗效。

RhoA/ROCK2是触发炎性级联反应的重要信号,随着老化进展,其信号蛋白在脑组织中表达显著增加,下调RhoA/ROCK2通路蛋白表达,可对抗Aβ多肽诱导的炎症级联反应,降低氧化应激水平,延缓神经突触丢失,促使神经元细胞存活,提升衰老造成的学习记忆功能减退,改善其认知能力〔19,20〕,由此可知,RhoA/ROCK2信号是防治AD的重要作用靶点,本文结果表明,Rhosin能增强芍药苷对AD的治疗效果,揭示芍药苷可能通过抑制RhoA/ROCK2通路激活改善AD大鼠认知功能障碍。

综上所述,芍药苷可下调RhoA及ROCK2蛋白表达,增强AD大鼠抗氧化活性,抑制其脑组织炎症产生,降低氧化应激水平,减轻海马神经元凋亡缺失,修复大鼠学习记忆能力,改善其认知功能,为芍药苷在AD临床治疗上的推广应用提供了新的有力证据,并探讨了其药理机制,后续会通过激活RhoA/ROCK2通路做更深入的研究。