LINC00707靶向miR-876-5p影响缺氧缺血脑损伤后海马神经元凋亡及氧化应激的机制

李肃 马海军 拜承萍

(青海大学附属医院 1急诊科,青海 西宁 810000;2急救中心;3神经内科)

缺氧缺血性脑损伤是造成神经系统疾病发生的重要原因,研究显示0.1%～0.2%新生儿会发生缺氧缺血性脑损伤,部分患儿或出现脑瘫、认知障碍等后遗症,氧化应激、神经细胞凋亡等均可引起缺氧缺血性脑损伤〔1,2〕。长链非编码RNA(LncRNA)是一类长度超过200 nt的内源性非编码RNA分子,其可参与神经系统神经元的多种生理过程,并可能调节神经细胞增殖及凋亡〔3,4〕。抑制LINC00707表达可减轻细胞损伤〔5〕。但LINC00707与缺氧缺血性脑损伤相关研究报道相对较少。Starbase预测LINC00707和miR-876-5p存在互补序列,研究表明银屑病角质形成细胞中miR-876-5p的表达下调,上调其表达可抑制细胞增殖及侵袭〔6〕。但miR-876-5p在缺氧缺血性脑损伤中的作用机制尚未可知。因此,本研究建立缺氧缺血脑损伤模型,探讨LINC00707是否可通过靶向调节miR-876-5p表达而影响海马神经元凋亡及氧化应激。

1 材料与方法

1.1材料与试剂 大鼠海马神经元细胞HT-22购自美国ATCC;RNA提取试剂、Lipofectamine2000、LINC00707过表达载体(pcDNA-LINC00707)及其对照空载体(pcDNA)购自美国Invitrogen;反转录试剂与SYBR Green荧光定量PCR试剂购自北京天根生化;si-LINC00707、si-NC、miR-876-5p mimics、miR-NC、anti-miR-876-5p、anti-miR-NC购自广州锐博生物;丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所;含有LINC00707和miR-876-5p互补序列的野生型载体WT-LINC00707与含有LINC00707和miR-876-5p突变序列的突变型载体MUT-LINC00707购自美国Prpmega;荧光素酶活性检测试剂盒、细胞凋亡检测试剂盒购自北京索莱宝;兔抗鼠活化的含半胱酸的天冬氨酸水解酶(Cleaved-caspase)-3抗体及其对应二抗购自美国Santa Cruz。

1.2实验处理与分组 建立缺氧缺血脑损伤细胞模型〔7〕:取对数生长期HT-22细胞,加入50 μmol/L谷氨酸与D-Hanks液浸泡30 min,培养基洗涤2次,加入含有15%胎牛血清的培养基继续培养24 h,记为Hypoxia ischemia组。同时将正常培养的细胞记为NC组。细胞转染:用不含血清的细胞培养液与si-NC、si-LINC00707、miR-NC、miR-876-5p mimics、anti-miR-NC+si-LINC00707、anti-miR-876-5p+si-LI-NC00707混合后室温孵育5 min(A液),用不含血清的细胞培养液与Lipofectamine2000转染试剂充分混合(B液),A液与B液充分混匀后室温孵育20 min,并将其加入HT-22细胞,6 h弃上清液后更换正常培养液,并继续培养48 h。细胞转染成功后进行缺氧缺血处理,分别记为si-NC+Hypoxia ischemia组、si-LINC00707+Hypoxia ischemia组、miR-NC+Hypoxia ischemia组、miR-876-5p+Hypoxia ischemia组、anti-miR-NC+si-LINC00707+Hypoxia ischemia组、anti-miR-876-5p+si-LINC00707+Hypoxia ischemia组。

1.3qRT-PCR检测LINC00707、miR-876-5p的表达水平 RNA提取试剂分别提取各组HT-22细胞总RNA,反转录合成cDNA,以cDNA 2 μl进行qRT-PCR扩增,反应条件:95 ℃预变性2 min,95 ℃变性30 s,59 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,共36次循环。应用ABI StepOnePlus荧光定量PCR仪检测LINC00707、miR-876-5p相对表达量。

1.4利用试剂盒检测MDA的水平与SOD、CAT的活性 收集各组HT-22细胞后采用反复冻融法裂解液细胞,按照试剂盒说明书检测MDA水平与SOD、CAT活性。

1.5流式细胞术检测细胞凋亡率 取各组HT-22细胞加入预冷PBS洗涤,1 000 r/min转速离心6 min后弃上清,加入500 μl结合缓冲液,按照凋亡检测试剂盒说明书检测细胞凋亡率。

1.6双荧光素酶报告实验检测LINC00707和miR-876-5p的靶向关系 用脂质体转染法将miR-NC、miR-876-5p mimics分别与WT-LINC00707或MUT-LINC00 707共转染至HT-22细胞,转染48 h后收集细胞,检测细胞相对荧光素酶活性。用脂质体转染法将pcDNA、pcDNA-LINC00707、si-NC、si-LINC00707分别转染至HT-22细胞,转染48 h后收集细胞,采用qRT-PCR实验检测细胞中miR-876-5p的表达量。

1.7Western印迹检测Cleaved-caspase-3蛋白表达量 取各组HT-22细胞加入适量RIPA裂解液提取细胞总蛋白,取50 μg蛋白样品上样并经SDS-PAGE电泳分离蛋白,分离的蛋白凝胶转移至PVDF膜,5%脱脂奶粉封闭2 h,分别加入Cleaved-caspase-3(1∶1 000)与内参β-actin抗体(1∶2 000)稀释液4 ℃孵育过夜,孵育二抗稀释液(1∶3 000),室温孵育1 h,应用ImageJ软件分析各条带灰度值。

1.8统计学分析 采用SPSS21.0软件进行t检验、方差分析。

2 结 果

2.1缺氧缺血处理的海马神经元细胞模型中,LINC00707和miR-876-5p的表达情况 与NC组比较,Hypoxia ischemia组LINC00707表达明显升高,miR-876-5p表达明显降低(均P<0.001),见表1。

表1 两组LINC00707和miR-876-5p的表达

2.2LINC00707低表达抑制缺氧缺血损伤后海马神经元凋亡和氧化应激 与NC组比较,Hypoxia ischemia组MDA水平明显升高,SOD、CAT活性明显降低,细胞凋亡率和Cleaved-caspase-3蛋白水平升高(均P<0.05);与si-NC+Hypoxia ischemia组比较,si-LINC00707+Hypoxia ischemia组MDA水平明显降低,SOD、CAT活性明显升高,细胞凋亡率和Cleaved-caspase-3蛋白水平明显降低(P<0.05),见图1、图2、表2。

1～4:NC组、Hypoxia ischemia组、si-NC+Hypoxia ischemia组、si-LINC00707+Hypoxia ischemia组图1 Western印迹检测Cleaved-caspase-3蛋白表达

图2 流式细胞仪检测各组细胞凋亡

表2 LINC00707低表达抑制缺氧缺血损伤后海马神经元凋亡和氧化应激

2.3miR-876-5p抑制缺氧缺血损伤后海马神经元凋亡和氧化应激 与miR-NC+Hypoxia ischemia组比较,miR-876-5p+Hypoxia ischemia组MDA水平明显降低,SOD、CAT活性明显升高,细胞凋亡率和Cleaved-caspase-3蛋白水平明显降低(均P<0.001),见表3、图3、图4。

图3 miR-876-5p抑制缺氧缺血损伤后海马神经元凋亡

1,2:miR-NC+Hypoxia ischemia组、miR-876-5p+Hypoxia ischemia组图4 miR-876-5p抑制缺氧缺血损伤后Cleaved-caspase-3蛋白表达

表3 miR-876-5p抑制缺氧缺血损伤后海马神经元凋亡和氧化应激

2.4LINC00707靶向结合miR-876-5p,调控miR-876-5p的表达 Starbase预测LINC00707和miR-876-5p存在结合位点,见图5。miR-876-5p过表达可降低野生型载体WT-LINC00707的荧光素酶活性(P<0.001),见表4。pcDNA组、pcDNA-LINC00707组、si-NC组、si-LINC00707组miR-876-5P表达水平依次为1.00±0.08、0.45±0.04、0.99±0.09、1.91±0.16,4组间miR-876-5P表达水平差异有统计学意义(P<0.05);pcDNA组、pcDNA-LINC00707 组miR-876-5P表达水平差异有统计学意义(P<0.05);si-NC组、si-LINC00707组miR-876-5P表达水平差异有统计学意义(P<0.05)。LINC00707可负向调控miR-876-5p的表达。

图5 Starbase对LINC00707和 miR-876-5p结合进行预测示意

表4 双荧光素酶活性检测

2.5anti-miR-876-5p可以逆转si-LINC00707对缺氧缺血损伤后海马神经元凋亡和氧化应激的影响 与anti-miR-NC+si-LINC00707+Hypoxia ischemia组比较,anti-miR-876-5p+si-LINC00707+Hypoxia ischemia组MDA水平明显升高,SOD、CAT活性明显降低,细胞凋亡率和Cleaved-caspase-3蛋白水平明显升高(均P<0.001),见表5、图6、7。

1～2:anti-miR-NC+si-LINC00707+Hypoxia ischemia组、anti-miR-876-5p+si-LINC00707+Hypoxia ischemia组;图7同图6 anti-miR-876-5p可以逆转si-LINC00707对缺氧缺血损伤后海马神经元凋亡

图7 miR-876-5p可以逆转LINC00707对缺氧缺血损伤后Cleaved-caspase-3蛋白表达水平的影响

表5 anti-miR-876-5p可以逆转si-LINC00707对缺氧缺血损伤后海马神经元凋亡和氧化应激的影响

3 讨 论

敲低LINC00707表达可减轻脂多糖诱导的人正常胚肺成纤维细胞损伤〔8〕。LINC00707具有促进人骨髓间充质干细胞的成骨作用〔9〕。另有研究表明,LINC00707在肝癌中呈高表达,并可促进肝癌细胞增殖及转移〔10〕。但LINC00707在缺氧缺血性脑损伤中的表达尚未可知。本研究结果提示,LINC00707在缺氧缺血性脑损伤中可能发挥重要调控作用。脑缺血后氧自由基生成量增加,而SOD、CAT等抗氧化酶过度消耗导致氧化应激反应加重,氧自由基可氧化不饱和脂肪酸并可破坏细胞膜从而造成核酸等损伤,MDA属于脂质过氧化产物,其含量与氧自由基密切相关〔11〕。本研究结果提示,干扰LINC00707表达可增强缺氧缺血脑损伤后海马神经元细胞抗氧化能力从而抑制氧化应激反应。氧化应激还可引起神经细胞凋亡,脑缺血发生后缺血核心区的主要表现为神经元凋亡,线粒体膜通透性改变可激活caspase级联反应从而激活caspase-3,caspase-3具有执行细胞凋亡的能力〔12〕。本研究结果提示,干扰LINC00707表达可抑制缺氧缺血脑损伤后海马神经元凋亡。

本研究证实,LINC00707与miR-876-5p存在靶向调控关系,提示LINC00707可能通过靶向miR-876-5p影响缺氧缺血脑损伤后海马神经元凋亡及氧化应激。研究表明miR-876-5p在乳腺癌〔13〕、肝细胞癌〔14〕、骨肉瘤〔15〕中表达下调,上调其表达可抑制肿瘤细胞增殖、迁移及侵袭。本研究结果提示,LINC00707可通过靶向miR-876-5p而促进缺氧缺血脑损伤后海马神经元凋亡及氧化应激。

综上,缺氧缺血脑损伤后海马神经元中LINC00707表达上调,miR-876-5p表达下调,LINC00707靶向结合miR-876-5p并可负向调控miR-876-5p的表达,干扰LINC00707表达可通过上调miR-876-5p表达而抑制缺氧缺血脑损伤后海马神经元凋亡及氧化应激,LINC00707可能成为预防与治疗缺氧缺血性脑损伤的新靶点。但仍需进行体内动物实验验证LINC00707/miR-876-5p在缺氧缺血性脑损伤中的作用机制。