VEGF水平及其受体分型和角膜细胞增殖能力的相关性

彭正武 邝国平 李植源 周小平 陈书扬 李振华 尹欣 冯少颖

(郴州市第一人民医院,湖南 郴州 423000)

血管内皮生长因子(VEGF)在血管生长中起重要作用。 VEGF是迄今为止对内皮细胞最有效的选择性促分裂原和血管生成因子,在血管生成过程中具有特异性刺激血管内皮细胞增殖的作用〔1〕。VEGF不仅是一种有效的血管生成和血管通透性诱导剂,而且还是一种内皮细胞特异性促分裂原,可促进内皮细胞增殖〔2〕。研究表明,多种生长因子参与了新血管的形成,包括表皮生长因子、肿瘤坏死因子-α、胰岛素样生长因子Ⅰ和Ⅱ及胰岛素样生长因子结合蛋白Ⅰ和Ⅱ。这些因子通过增强 VEGF及其受体分型(VEGFR1和VEGFR2)表达和产生来整体或部分调节新血管的形成〔3〕。本实验研究血液和房水中VEGF、VEGFR1、VEGFR2和促红细胞生成素(EPO)的表达水平。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2019年10月至2021年1月于郴州市第一人民医院就诊和住院的新生血管性青光眼(A组)、原发性青光眼(B组)、年龄相关性白内障患者(C组)各20例。纳入标准:特殊眼科检查:远距和近距视力、裂隙灯显微镜、眼压、眼底检查、视野、光学相干断层扫描(包括对诊断为青光眼患者的相关检查)等。3组一般资料差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 3组血清及房水中VEGF、EPO水平比较

表1 3组一般资料

1.2样本采集 (1)血清标本采集:早晨,空腹,采集立方静脉血3～4 ml,置于试管中,低温超速离心机分离,4 ℃离心。10 min(2 000 r/min)后,从试管中取出0.3～0.4 ml血清,置于无菌Ep管(0.5 ml)中,贴上序列号,-70 ℃超低浓度保存。(2)房水标本的采集:进入手术室后,患者平躺在手术台上,清洁结膜囊,定期对布片消毒,选择全身麻醉或球后麻醉。混合量为2%。将3.5 ml麻醉球注入利多卡因和 0.75% 丁哌卡因,戴上眼罩,用眼睑担架张开眼睑。用带有25号针头的1 ml注射器从角膜缘作穿刺口进入前房,从正面取出0.15～0.20 ml的眼睑角膜后,立即将其放入0.5 ml 无菌Ep管中,编号并存放在超低温(-70 ℃)冰箱中。在收集房水样本期间,必须小心不要损坏眼睛的虹膜、晶状体或角膜内皮。

1.3VEGF水平检测 (1)标准品的稀释与加样:在酶标包被板上设标准品孔10孔,在第一、第二孔中分别加标准品100 μl,然后在第一、第二孔中加标准品稀释液50 μl,混匀;然后在第三和第四孔中先各取50 μl弃掉,再各取50 μl分别加到第五、第六孔中,再在第五、第六孔中分别加标准品稀释液50 μl,混匀;混匀后从第五、第六孔中各取50 μl分别加到第七、第八孔中,再在第七、第八孔中分别取50 μl加到第九、第十孔中,再在第九、第十孔中分别加标准品稀释液50 μl,混匀后从第九、第十孔中各取50 μl弃掉(稀释后各孔加样量均为50 μl,水平分别为900、600、300、150、75 pg/ml)。(2)加样:分别设置待测的空白孔和样孔。将待测样品以1∶1的样品比例加入含有待测稀释剂的微量滴定板的待测样品孔中,每孔加入25 μl。(3)温育:将反应板的孔用玻璃纸胶带封好后,在37 ℃恒温烘箱中反应30 min。(4)配液:用蒸馏水将清洗液稀释30倍,放置备用。(5)洗涤:小心撕下封口板上的透明胶纸,倒入液体,让其旋干。将配制好的清洗液反复清洗5次,每次放置约30 s。(6)加酶:除空白孔外,每孔加酶标试剂50 μl。(7)温育:将反应板的孔用玻璃纸胶带封好后,在37 ℃恒温烘箱中反应30 min。(8)洗涤:小心撕下封口板上的透明胶带,倒入液体并甩干。将配制好的清洗液反复清洗5次,每次放置约30 s。(9)显色:每孔加入显色剂A和B 50 μl,轻轻摇晃混合,在37 ℃培养箱中避光反应15 min。(10)终止:每孔加入终止液50 μl,终止反应。此时,样品将很快从蓝色变为黄色。(11)检测:用酶标仪检测450 nm处的吸光度(OD)值。

1.4EPO水平的检测 (1)标准品稀释加样:将10孔标准品置于酶标包被板上,第1、2孔加入100 μl标准品,第1、2孔加入100 μl。加入50 μl 标准稀释液并混合均匀。然后从第3和第4孔中取出50 μl并丢弃,将50 μl分别分入第5、第6、第5和第6孔。添加 50 μl 标准稀释剂。搅拌均匀。混合后,分别从5和6孔中取出50 μl加入7和8孔中,然后从7和8孔中取出50 μl并先加入。将50 μl添加到孔9和10。将标准稀释液分别放入第9、10孔,分别取第9、10孔50 μl,混匀弃去(稀释后每孔体积为50 μl,浓度为36、24、12、6、3 IU/L)。(2)加样:分别设置待测的空白孔和样孔。在酶联免疫吸附试验(ELISA)包被板的进样孔中加入20 μl样品稀释液,再加入30 μl样品。将样品稀释剂和待测样品分别以2∶3的比例加入样品孔中。(3)孵育:将反应板的孔用玻璃纸胶带封好后,在37 ℃恒温烘箱中反应30 min。 (4)液体配制:用蒸馏水将清洗液稀释30倍,放置备用。 (5)清洗:小心撕下封口板上的透明胶纸,倒入液体,让其旋干。将配制好的清洗液反复清洗5次,每次放置约30 s。(6)加酶:除空白孔外,每孔加酶标试剂50 μl。(7)孵育:将反应板的孔用玻璃纸胶带封好后,在37 ℃恒温烘箱中反应30 min。(8)清洗:小心撕下封口板上的透明胶带,倒入液体并甩干。将配制好的清洗液反复清洗5次,每次放置约30 s。(9)显色:每孔加入显色剂A和B 50 μl,轻轻摇晃混合,37 ℃避光反应15 min。(10)终止:每孔加入终止液50 μl,终止反应。此时,样品将很快从蓝色变为黄色。 (11)检测:用酶标仪检测450 nm处OD值。

1.5统计学方法 采用SPSS14.0软件进行单因素方差分析、配对样本t检验、Pearson相关性分析。

2 结 果

2.1绘制标准曲线 测量所有样品OD值,并根据VEGF及EPO标准品含量和检测到的相应OD450 nm值制作校准曲线。 见图1、图2。

图1 VEGF标准曲线

图2 EPO标准曲线

2.23组血清及房水中VEGF、EPO水平检测 3组血清及房水中VEGF水平、房水中EPO水平差异有统计学意义,且A、B组以上各指标明显高于C组(均P<0.001),3组血清EPO水平差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

2.33组血清VEGFR1、VEGFR2含量比较 A、B组血清VEGFR2含量均较C组明显增加(均P<0.05);3组VEGFR1含量未见明显差异(P>0.05)。见表2。

表2 3组血清VEGFR1、VEGFR2含量比较

2.4VEGF和EPO在新生血管性青光眼房水中相关性比较 在新生血管性青光眼房水中VEGF和EPO水平无明显相关性(r=-0.182,P>0.05)。见图3。

图3 新生血管性青光眼组房水中VEGF和EPO的相关性

3 讨 论

新生血管性青光眼是一种常见的继发性青光眼,由虹膜表面和前房之间的角度处的新血管生长及小梁网附着在虹膜周围组织上引起。眼压升高。继发性青光眼很常见〔4〕。新生血管性青光眼形成的病理过程是眼部缺血、缺氧或炎症的反复刺激、前房和虹膜结缔组织的生长及新血管的形成〔5〕。高血压下视网膜缺血缺氧持续恶化,刺激新生血管形成,影响视神经和视觉功能,引起注意力不集中,严重影响生活质量〔6〕。该病常继发于视网膜静脉阻塞、糖尿病视网膜病变、视网膜缺血综合征等疾病,其中新生血管性青光眼占增殖性糖尿病视网膜病变的1%～17%。主要原因是其与糖尿病视网膜病变有关〔7〕。血管性青光眼虹膜血管生成的病因尚不清楚,但多数学者认为是视网膜缺氧导致血管生成〔8〕。

在目前的研究中,新血管的形成和成熟是一个非常复杂的过程,需要调节多种不同的血管相关细胞因子。VEGF 及其受体参与血管生成的病理生理机制〔9〕。 研究表明,VEGF、VEGFR1和VEGFR2的共同特征是在催化结构域中存在酪氨酸激酶插入区。这种酪氨酸激酶的活性被受体-配体结合和受体自磷酸化激活。一个单元格中有许多单元格。酶和其他反应在细胞生长和分化中起重要作用,只有 VEGFR 参与内皮细胞增殖和血管生成〔10,11〕。本研究结果证实,房水中VEGF显著增加在新生血管性青光眼产生机制中起着非常重要的作用〔12〕。生理条件下,VEGF、VEGFR1 和 VEGFR2 有助于维持血管完整性。缺血、缺氧等病理生理环境可能会迅速增加VEGF、VEGFR1和VEGFR2的表达,促进新血管的形成〔13〕。

目前的临床应用和药物研究表明,VEGF的抑制作用并不能完全阻止血管生成的过程,提示可能存在其他促进血管生成的因素〔14〕。VEGF、VEGFR1和VEGFR2是缺氧诱导血管生成的重要细胞因子。当身体缺氧时,身体不仅会激活低氧诱导因子(HIF)-1,还会上调VEGF基因的表达、EPO基因表达〔15〕。本研究结果说明,在青光眼发病后眼压高的情况下,局部EPO水平升高可能与视盘灌注不足和组织缺血缺氧有关。视网膜局部组织中产生的EPO导致房水中EPO水平升高〔16〕。这一推理在缺血性诱导的视网膜新生血管形成的小鼠模型中得到证实。房水中EPO水平升高可能不是由于血-视网膜屏障的破坏,但不能排除可能存在其他控制眼中EPO水平的机制。近年来,对人体重要器官心脏和肾脏缺氧的研究表明,HIF-1在缺氧状态下可以调节EPO、GAPDH、胰岛素样生长因子(IGF)-2等多个靶基因的表达。新生血管性青光眼房水中EPO水平升高可能与缺血缺氧眼组织视网膜中HIF-1表达升高有关。许多基因包括VEGF都参与了缺氧反应。酸性脱羧酶和糖酵解基因被诱导以增高局部EPO水平〔17〕。

后部或前部局部缺氧的广泛受累是新生血管性青光眼的重要原因。研究表明,VEGF、VEGFR1、VEGFR2和EPO可能发挥更多作用,它在新生血管性青光眼形成的病理过程中起重要作用〔18〕。推测眼内VEGF、VEGFR1、VEGFR2、EPO升高可能与青光眼发病后组织缺血缺氧相关。高眼压会产生局部组织,导致眼部缺血缺氧。缺氧是激活HIF-1的最重要因素。在缺氧诱导下,EPO是HIF-1识别的第一个靶点,血管生成的调控主要是由缺氧诱导的HIF-1过度表达引起的一系列变化〔19〕。研究表明,HIF-1可以直接调节VEGF、VEGFR1、VEGFR2和EPO表达。在缺血缺氧条件下,HIF-1容易被激活,分泌组织EPO增加,促进红细胞分化成熟。同时,VEGF、VEGFR1和VEGFR2水平上调并促进形成〔20〕血管内皮组织。

综上,血管性青光眼患者VEGF、VEGFR2和EPO局部水平升高,但EPO与虹膜血管生成无明显相关性。