宏基因组二代测序技术在肺结核诊断中应用价值的meta分析

沃拉孜汗·玛德尼亚提,迪力夏提·图尔迪麦麦提,李梦晨,拜合提尼沙·吐尔地

(新疆医科大学第一附属医院 呼吸重症监护室,新疆 乌鲁木齐 830000)

肺结核(pulmonary tuberculosis,PTB)是由结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis,MTb)感染并破坏肺组织而起病的一种慢性呼吸道疾病[1]。根据WHO最新报告显示[2],2020年约990万例新发结核病患者和约150万死亡患者,新报告PTB患者为476万例,提示全球在防治结核病方面进展缓慢,且相当大比例的PTB病例仍然是临床诊断,而不是细菌学证实[3]。因此早期准确检测MTb对于PTB诊断、及时治疗和预防传播具有重要意义。传统的抗酸杆菌染色法(acid fast bacteria ,AFB)虽操作简单且快速,但敏感度较低而受限制。分枝杆菌培养方法耗时,一般需要2～8周,且标本容易受到污染[4]。T-SPOT TB试验敏感度和特异度优于传统方法,但其检测结果可能会受到年龄、BMI、免疫状态和其他因素的影响[5]。Xpert MTb/RIF具有较高敏感度和特异度,然而Xpert MTb/RIF检测技术的可用性依赖于复杂仪器并且成本高,且2020年全球数据显示[6],仅59%的PTB病例经细菌学确诊,提示MTb检测仍有较大差距,有必要开发快速检测MTb以进行PTB诊断的方法。

宏基因组二代测序(metagenomic next-generation sequencing,mNGS)是一种快速检测包括MTb在内的各种病原体的新技术[7],mNGS不需要对病原体进分离培养和纯化,直接从临床样本中提取所有遗传物质片段(DNA或RNA)并同时独立测序,构建生物参考数据库和严格的序列读取映射来识别可能的病原体[8]。迄今为止,已有多项研究探讨了mNGS在发现致病病原体和指导靶向抗菌治疗方面的价值[9],多数研究结果显示mNGS诊断PTB敏感度优于培养和AFB,同时与Xpert相似[10]。然而鉴于研究样本量、标本类型以及研究方法的限制,我们检索目前国内外应用mNGS技术诊断PTB的相关研究,采用meta分析方法评价mNGS应用于不同肺标本检测对PTB诊断的价值。

1 资料与方法

1.1检索策略

1.1.1计算机检索 PubMed、Embase、Cochrane Library、CNKI数据库、万方、维普等数据库,收集采用mNGS技术诊断PTB的诊断性试验,检索时间为建库至2022年11月。

1.1.2检索词选择 在CNKI数据库、万方、维普中文检索词:结核、肺结核等,宏基因组二代测序、宏基因二代测序、mNGS等。在PubMed、Embase、Cochrane Library数据库中英文检索词:tuberculosis、Tuberculoses、Kochs Disease、Mycobacterium tuberculosis Infection等,Tuberculosis, Pulmonary、Tuberculoses, Pulmonary、Pulmonary Tuberculoses、Pulmonary Tuberculosis、Pulmonary Consumption、Consumption, Pulmonary、Pulmonary Consumptions、Pulmonary Phthisis、Phthises, Pulmonary、Pulmonary Phthises等,Metagenomic Next-Generation Sequencing、mNGS等。中文检索策略(以知网为例):(主题=肺结核+结核)AND(主题=二代测序+mNGS+宏基因二代测序+宏基因组二代测序);英文检索策略(以PubMed为例):((tuberculosis[Title/Abstract])OR((Tuberculoses, Pulmonary[Title/Abstract])OR(Pulmonary Tuberculoses[Title/Abstract])OR(Pulmonary Tuberculosis[Title/Abstract])OR(Pulmonary Consumption[Title/Abstract])OR(Consumption, Pulmonary[Title/Abstract]))OR(Consumptions, Pulmonary[Title/Abstract])OR(Consumptions, Pulmonary[Title/Abstract])OR(Pulmonary Phthisis[Title/Abstract])OR(Phthises, Pulmonary[Title/Abstract])OR(Phthisis, Pulmonary[Title/Abstract]))OR(Pulmonary Phthises[Title/Abstract])AND(Metagenomic Next-Generation Sequencing[Title/Abstract])OR(mNGS[Title/Abstract])。

1.1.3检索方法 在上述数据库中检索相关的原始论文,并对文献所用的关键词及主题词进行分析,进一步确定文献检索关键词,并采用主题词结合自由词的方法进行文献搜索,对所得文献、文体、摘要按照纳入排除标准进行筛选,符合标准的文章经全文阅读进一步确定纳入文献,并对相关文献的参考文献进行筛选保证文献查全。

1.2文献纳入和排除标准

1.2.1纳入标准 ①采用mNGS技术诊断PTB的研究,能直接或间接获取四格表数据。②研究对象为临床上疑似PTB或肺部感染的成人患者,且有明确的诊断标准。肺结核诊断标准参照《肺结核诊断》(WS 288-2017),临床诊断标准为结合影像特征和结核免疫学检测阳性,排除其他疾病,且抗结核药物治疗经评估有效。确诊标准为具有病原学或者病理诊断依据,或采用现代分子生物学检测手段(PCR法、基因检测等)结合临床资料等进行综合分析的确诊患者。③详细提供mNGS技术操作流程的研究,标本类型不限。

1.2.2排除标准 ①相关数据不完整,无法获取四格表数据的研究文献。②研究病例数不足10例的文献。③病例报告、综述、会议论文等。④排除诊断标准不一致的文献。

1.3文献的筛选与资料提取 由2名研究者先分别独立对初检文献和摘要独立阅读,再根据纳入与排除标准对检索出的文献独立进行筛选,对可能纳入分析的文章阅读全文,并进行质量评价和相关资料提取。提取内容包括研究的一般信息(作者、年份、样本量、研究方法)、标本类型、诊断标准、mNGS测序方法和测序条件、四格表数据即真阳性值(TP)、假阳性值(FP)、假阴性值(FN)、真阴性值(TN)。

1.4文献质量评价 本次研究严格进行质量评价,由2名研究员在RevMan5.3软件上按照Cochrane-2偏倚风险评估工具进行评分,意见若不同,则与第三方进行商讨后决定,并用“高风险”“不确定风险”“低风险”对文章质量进行评估。

1.5统计学方法 采用Revman5.3软件对纳入研究进行质量评价。使用StataSE16软件进行分析,提取各独立研究的诊断性实验四格表数据,绘制敏感度与特异度的森林图,根据P值和I2值评估异质性。I2≤50%,异质性较小,采用固定效应模型进行分析;I2>50%为异质性较大,采用随机效应模型。分析计算纳入研究的敏感度、特异度、阳性似然比(positive likelihood ratio,PLR)、阴性似然比(negative likelihood ratio,NLR)、诊断比值比(diagnostic odds ratio, DOR)及其95%可信区间(confidence interval,CI)。绘制汇总受试者工作特征(Summary receiver operating characteristic curve,SROC)曲线,并计算曲线下面积(area under the curve, AUC)。针对明显的异质性寻找产生异质性的可能来源,分组并采用随机效应模型进行亚组分析。敏感度分析使用Cook距离用于识别强烈影响的研究,以及标准化残差的散点图用于检测异常值。Deeks’漏斗图不对称性检验用于评估发表偏倚,双尾P值<0.05差异有统计学意义。

2 结 果

2.1文献检索结果 检索到文献共447篇,剔除重复文献后得到初始文献314篇,浏览文题及摘要后排除不相关研究、综述和病例报告等文献302篇,纳入12篇文献;通过阅读全文,排除无法提取四格表数据的文献1篇,最终纳入11篇[11-21]符合标准的文献进行meta分析,见图1。

图1 文献检索流程图

2.2纳入研究的基本特征 纳入11篇研究文献,发表年份在2019-2022年,研究地区均为中国,PTB组734例,非PTB组1261例,研究中包含了易混淆的疾病并给出了明确的PTB诊断标准。2篇文献明确研究mNGS在痰菌阴性PTB中的诊断价值,其余9篇文献研究疾病为疑似PTB或肺部感染患者。为阐明mNGS技术应用于不同标本类型中诊断PTB的价值,本研究未对标本类型进行限制,在纳入研究的7篇文献中可获得mNGS应用于肺标本[包括痰、肺组织、支气管肺泡灌洗液(Broncho alveolar Lavage Fluid,BALF)、血液、胸腔积液等]检测PTB的诊断价值,8篇文献中可获得mNGS应用于BALF检测诊断PTB的应用价值,3篇文献中可获得mNGS在肺组织中的诊断价值,因此我们对不同的标本类型均进行了meta分析。另外,mNGS的操作方法和测序条件不规范,我们严格纳入使用宏基因组二代测序方法检测MTb的研究,并对mNGS测序方法及测序平台进行了总结,11篇研究文献测序方法均选择了DNA序列,只有1篇文献中未提及测序方法及测序平台,7篇文献测序条件均在BGISEQ平台上进行测序,3篇文献在其他平台(主要是Illumina NextSeq平台)上进行测序。纳入研究的特征表见表1,mNGS检测3种标本诊断PTB的四格表数据见表2。

表1 纳入研究文献特征

表2 mNGS检测不同临床标本诊断PTB的四格表数据

2.3质量评价 11篇文献中3篇为中文文献,8篇为英文文献;Shi等[12]的研究中金标准包含了mNGS结果,故评价为“高风险”,其余所有研究未说明金标准诊断是否在不知晓mNGS的结果下进行的,故评为“不确定风险”;除了Zhou等[11]的研究外,其余研究未说明纳入研究的病例是否为连续或随机,故评为“不确定风险”;所有研究临床适用性评为“低风险”。见图2～3。

图2 质量评估详细结果

图3 风险偏倚评估图

2.4mNGS技术诊断PTB的应用价值

2.4.1异质性检验 SROC曲线形状不呈现典型的“肩臂状”,且在发表偏倚中P>0.05, 表明不存在阈值效应。在mNGS检测肺标本的异质性结果显示,敏感度I2=80.36,特异度I2=53.33;在BALF中,敏感度I2=86.04,均采用随机模型进行合并。在肺组织中I2均为0,表明不存在显著异质性。

2.4.2诊断价值参数汇总分析 Meta分析结果示,mNGS检测肺标本诊断PTB敏感度为70%(95%CI:58%～79%),特异度为99%(95%CI:98%～100%),PLR为106.9(95%CI:31.1～366.6),NLR为0.31(95%CI:0.21～0.43),DOR为350(95%CI:81～1512);mNGS检测BALF诊断PTB敏感度为71%(95%CI:55%～83%),特异度为99%(95%CI:97%～100%), PLR为76.4(95%CI:26.6～218.9),NLR为0.30(95%CI: 0.18～0.48),DOR为258(95%CI:75～895);mNGS检测肺组织诊断PTB敏感度为81%(95%CI:69%～89%),特异度为97%(95%CI:88%～99%),PLR为26.0(95%CI:6.6～102.4),NLR为0.19(95%CI:0.11～0.33),DOR为135(95%CI:29～639)。见表3,图4～6。

表3 mNGS在不同标本类型中诊断PTB的参数汇总

图4 mNGS检测肺标本诊断PTB的灵敏度和特异度森林图

图5 mNGS检测BALF诊断PTB的灵敏度和特异度森林图

图6 mNGS检测肺组织诊断PTB的灵敏度和特异度森林图

2.4.3SROC分析 绘制mNGS检测不同标本诊断PTB的SROC曲线,结果显示:mNGS检测肺标本的AUC为0.97(0.95～0.98),mNGS检测BALF的AUC为0.99(0.98～1.00),mNGS检测肺组织标本的的AUC为0.97(0.95～0.98)。见图7。

图7 不同标本诊断PTB的SROC曲线 a.mNGS检测肺标本诊断PTB的SROC曲线(图中对应研究编号依次为:①Chen等[13],②Fu等[21],③Jin等[14],④Zhou等[11],⑤Zhu等[16],⑥孙雯雯等[18],⑦王春等[17]);b.mNGS检测BALF诊断PTB的SROC曲线(图中对应研究编号依次为:①Chen 等[13],②jin等[14],③Liu等[15],④Shi等[12],⑤Xu等[20],⑥Zhu等[16],⑦王春等[17],⑧赵素娥等[19]);c.mNGS检测肺组织诊断PTB的SROC曲线(图中对应研究标号依次为:①Jin等[14],②Zhu等[16],③王春等[17])

2.4.4亚组分析和敏感度分析 为探讨异质性来源,我们对mNGS检测BALF标本检测的研究按照研究类型、mNGS测序平台、痰涂片状况进行亚组分析,结果显示研究类型和mNGS测序平台亚组间敏感度值一致(P>0.05);然而,痰菌阴性PTB研究的敏感度[89%(81%～97%)]显著高于痰菌阳性PTB研究的敏感度[64%(54%～73%)](P<0.05)。敏感度分析表明,整体研究结果稳定,没有明确的异常值,但可看出Zhu等[16]和Xu等[20]的研究在目前的工作中影响较大,这与我们亚组分析结果一致。亚组分析及敏感度分析结果见表4和图8。

表4 mNGS检测 BALF的亚组分析

图8 mNGS检测BALF的敏感性分析 a.拟合优度分析;b.双变量正态性分析;c.影响分析;d.异常值检测,图中对应研究编号依次为:①Chen等[13],②jin等[14],③Liu等[15],④Shi等[12],⑤Xu等[20],⑥Zhu等[16],⑦王春等[17],⑧赵素娥等[19]

2.4.5发表偏倚 我们绘制了mNGS检测3种标本的Deeks’漏斗图,未发现发表偏倚(P>0.05),见图9。

图9 mNGS检测3种标本的Deeks'漏斗图 a.mNGS检测肺标本诊断PTB的Deeks'漏斗图; b.mNGS检测BALF诊断PTB的Deeks'漏斗图; c.mNGS检测肺组织诊断PTB的Deeks'漏斗图

3 讨 论

MTb作为细胞内病原体,生长缓慢、较难培养[22],如何快速、准确检测MTb已成为近几年的研究热点。mNGS通过非靶向DNA/RNA测序对细菌、真菌、病毒和寄生虫序列的检测,促进了病原体的快速鉴别[23-24],既往研究显示mNGS诊断感染性疾病的敏感度和特异度分别为50.7%和85.7%[9],并且受先前抗生素使用的影响较小,被认为是检测感染性疾病有前途的技术。

我们的meta分析结果显示,mNGS检测BALF诊断PTB的敏感度(71% 95%CI:55%～83%)低于已报道的Xpert MTb/RIF的敏感度(87% 95%CI:84%～90%)[25],但特异度(99% 95%CI:97%～100%)高于Xpert MTb/RIF(92% 95%CI:91%～93%),且在不同的标本中mNGS检测的AUC值均接近于1,且SROC曲线均靠近左上角,说明mNGS具有很高的诊断价值,DOR值均大于1,提示mNGS的判别效果较好,然而,PLR(>10)和NLR(>0.1)说明mNGS的诊断优势在于确诊疾病而非排除疾病,因此对于mNGS检测MTb阴性的结果不能完全排除MTb感染,应慎重解读。在我们的研究中mNGS应用于肺标本和BALF检测对于PTB的诊断效应相当,但值得一提的是,mNGS检测肺组织标本中的敏感度[81%(95%CI:69%～89%)]高于BALF标本[71%(95%CI:55%～83%)],可能原因为活检会导致组织和细胞的破坏,细胞内的MTb被完全暴露,因此检测MTb的敏感度将会提高,这与Fu等[21]结果一致,mNGS检测肺组织诊断MTb的效应比BALF标本更敏感,但由于肺活检对人体侵入伤害性更大,因此在临床工作中更应该权衡利弊。

在我们的meta分析中,既没有观察到阈值效应也没有观察到发表偏倚。然而,研究之间的敏感度存在很大的异质性。由于肺标本组包括了BALF、肺组织、痰、血液等各种临床标本,并且各研究纳入所包含的标本类型不尽相同,异质性来源因素本就较多,因此我们对BALF组进行了亚组分析,发现mNGS测序平台和研究类型并不是异质性的主要来源。然而,痰菌阴性PTB的2篇研究敏感度值很高(P<0.05),在剔除这两篇文献后汇总敏感度,发现异质性降为0,因此我们有理由怀疑这2篇研究为导致异质性的主要来源,但这也提示mNGS应用于BALF检测对于痰菌阴性PTB的诊断价值更高,这一结果证实了Jin等[14]研究结果,mNGS对痰液检测没有优势,而在痰菌阴性PTB中的表现优于痰菌阳性PTB,而与已发表的数据对比可知,诊断痰菌阴性PTB的敏感度(89% 95%CI:81%～97%)高于Xpert MTb/RIF检测痰菌阴性PTB的敏感度(86% 95%CI:80%～92%)[25],证实了mNGS检测BALF对菌阴性PTB具有很高的诊断价值。

mNGS作为一种无偏倚测序方法,理论上可以检测临床样本中所有的病原菌,因此,除了具有很高的敏感度和特异度的优势外,在鉴别混合感染方面具有更大的潜能。既往研究表明[26],mNGS 诊断混合性肺部感染的敏感度为97.2%,远高于常规检测(13.9%,P<0.05),并且mNGS的病原体检测范围比传统检测更广。Xu等[27]的研究结果也表明mNGS是检测混合感染的强大工具,最常见的组合是细菌-细菌共感染,他们发现mNGS除了能够检测常见病原体外,也能够检测诺卡氏菌、肺孢子菌等罕见且难以培养的病原体,为进一步了解肺部感染患者的微生物分布特征和病原体溯源提供帮助,为此类患者的抗生素治疗提供了更深入的了解。mNGS还可以通过对抗生素耐药基因进行测序,在耐药性预测方面也具有巨大潜力,对指导治疗方案和改善抗生素管理提供了新的诊断证据[28]。总而言之,mNGS在病原体检测方面具有很大的优势,能为诊疗混合感染的PTB提供更多的临床价值。然而,mNGS检测费用较高,导致在临床上广泛使用受限制,并且由于mNGS读数丰度低,在耐药性检测方面也存在一定的缺陷[29],需要不断地探索和完善mNGS检测功能。

本研究存在以下不足:(1)多数研究为回顾性研究,前瞻性研究很少,研究方法学质量不高;(2)纳入的研究样本量较小,mNGS诊断痰菌阴性PTB的研究文献较少,评估诊断准确性的能力不足;(3)有些研究文献对标本类型未进行明确规定,有些研究未明确说明纳入研究的患者曾经是否用过抗结核药物,导致评估mNGS诊断效应存在误差。我们的meta分析研究显示,mNGS检测肺标本、BALF、肺组织对于PTB具有很高的诊断性能,可作为一种快速诊断的辅助工具,尤其在痰菌阴性PTB的诊断价值更突出,对于难以诊断以及合并感染的PTB可选择mNGS进行诊疗。针对本研究存在的局限性,今后仍需更多的前瞻性、大样本及多中心的研究进一步证实mNGS的诊断价值。