鲿科鱼类DNA条形码鉴定及系统进化研究

刘红艳,熊 飞,翟东东,王 莹,夏 明,陈元元

( 1.江汉大学 生命科学学院,湖北省汉江流域特色生物资源保护开发与利用工程技术研究中心,湖北 武汉 430056; 2.江汉大学,持久性有毒污染物环境与健康危害湖北省重点实验室,湖北 武汉 430056 )

鲿科属辐鳍鱼纲真骨下纲鲇形目,为鲇形目中形态高度多样化的类群之一[1],其种类繁多,分布广,形态多样,而且不断地有鲿科新物种被发现[2-5],对鱼类研究来说,精确的鉴定物种至关重要。传统鉴定主要以形态特征为主要依据,如可数性状和可量性状及一些解剖结构特点。然而,传统的鱼类分类需要测量大量完整的标本。有时,我们只能获得少量的样本或不完整的样本,此外,形态相似的物种很难通过表型特征来区分,这些因素给鲿科物种鉴定带来了较大的困难[6]。黄颡鱼属(Pelteobagrus)、拟鲿属(Pseudobagrus)和属(Leiocassis)的一些种的属名已被修订过多次[7-9],鲿科相似种的鉴定和系统发育关系仍存在争议。因此,选择一种更为有效和便捷的鱼类鉴定方法,对其分类和进化关系的研究是十分重要的。

DNA条形码是指生物体内能够代表该物种的、有足够变异的、标准的、易扩增的并且相对较短的DNA片段,可以快速、准确地进行物种鉴定[10-11],DNA条形码已成为物种鉴定的重要工具[12]。线粒体DNA的COⅠ基因进化速率适中,并且引物通用性好,易于扩增,已经成为物种快速、准确鉴定的一个标准分子标签[13-15]。

鲿科是鱼类区系里的一个复杂分类单元。彭作刚等[16]以线粒体Cytb基因片段分析了部分鲿科鱼类的系统分类关系,但一些鲿科鱼类的归属问题仍未得到一致结论;梁宏伟等[17]用线粒体的COⅠ基因研究了部分鲿科鱼类的分类关系,但涉及的物种较少。笔者通过对鲿科5属36种鱼类214条线粒体COⅠ基因序列进行分析,探讨基于线粒体COⅠ基因作为DNA条形码在鲿科鱼类物种鉴定中的有效性,同时阐明其系统进化关系,以期为鲿科鱼类的物种鉴定和系统分类提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 研究材料

2016—2018年于金沙江下游溪洛渡-向家坝库区水域采集了黄颡鱼(P.fulvidraco)、瓦氏黄颡鱼(P.vachellii)、乌苏里黄颡鱼(P.ussuriensis)、凹尾拟鲿(P.emarginatus)和中臀拟鲿(P.medianalis)5种鲿科鱼类样本44尾。采集物种的形态学鉴定主要依据《中国动物志:硬骨鱼纲 鲇形目》[1]和《四川鱼类志》[18],每个样品取其尾鳍和肌肉组织保存于95%乙醇中备用。另外从美国国家生物技术信息中心网站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)下载31种鲿科鱼类的COⅠ基因序列170条。共有鲿科鱼类的5属36种,214尾鱼类样本(表1)。

表1 研究所用样本信息和GenBank登录号Tab.1 Species information and GenBank accession numbers of COⅠ genes

1.2 DNA提取、PCR扩增和序列测定

鲿科鱼类基因组DNA采用Foregene动物组织基因组试剂盒法进行提取,获得的DNA用TE缓冲液溶解,存放于-20 ℃备用。

PCR扩增引物采用鱼类COⅠ序列通用引物FishF1/FishR1和鲇形目鱼类COⅠ序列特异性扩增引物CatF1/CatR1。Fish F1:5′-TCAACCAACCACAAAGACATTGGCAC-3′￠;Fish R1:5′-TAG ACTTCTGGGTGGCCAAAGAATCA-3′￠;Cat F1:5′-TCTCAACCAACCATAAAGACATTGG-3′;Cat R1:5′-TATACTTCTGGGTGCCCAAAGAATCA-3′￠。

PCR反应总体积为50 μL:上、下游引物各1.0 μL (浓度为10 μmol/L),基因组DNA模板1.0 μL(约20 ng),灭菌蒸馏水22.0 μL,2×PCR mixture溶液25.0 μL。PCR 扩增程序:94 ℃预变性5 min,之后进行35个循环:94 ℃变性30 s、52 ℃退火45 s、72 ℃延伸45 s,最后再72 ℃延伸10 min。反应在T100型PCR仪(BIO-RAD)上进行。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测,判定PCR产物为目的条带后,送至天一辉远生物科技有限公司进行双向测序,测得的序列提交至GenBank(MN660185～MN660228)。

1.3 数据分析

采用Chromas软件查看测序波峰图,将双向测得的序列拼成一条完整的序列。使用MEGA 7.0软件[19]中的Muscle程序对所有的序列进行同源比对,进行序列的编辑和剪切,保留相同长度的同源序列用于后续遗传分析。利用MEGA 7.0软件统计变异位点、碱基组成情况,基于K2P双参数模型计算种内、种间遗传距离。利用ABGD软件[20]确定物种的运算分类单元,采取默认参数设置,选取K2P距离矩阵模型,计算物种的运算分类单元数。利用RAxMLv8.1.17软件[21]构建鲿科鱼类的最大似然法系统进化树,选取GTR+I+G替代模型,运行1 000 000代重复。

2 结 果

2.1 COⅠ序列信息

笔者获取了214尾鲿科鱼类的形码序列,包含鲿科5个属,36个物种。经过同源比对后,保留线粒体COⅠ基因的528 bp序列用于条形码分析。所有COⅠ序列均未发现缺失、插入。A、T、C、G平均碱基组成分别为:A 24.7%、T 30.0%、C 27.7%、G 17.6%,平均碱基含量A+T(54.7%)高于C+G(45.3%)。在528 bp的COⅠ序列位点中,有456个不变位点和72个变异位点;变异位点中,有51个是转换位点,21个是颠换位点。

2.2 遗传距离分析

图1 鲿科鱼类种内、种间遗传距离频率分布Fig.1 Histogram of genetic distance within species and between species

表2 鲿科鱼类平均种内遗传距离和平均种间遗传距离Tab.2 Mean intraspecific and interspecific genetic distances of Bagridae species

表3 种内和种间最大和最小遗传距离的条形码间隙Tab.3 Barcoding gap of maximum and minimum intraspecific and interspecific genetic distances

2.3 运算分类单元分析及系统发育树构建

ABGD分析结果显示,36个物种可分为25个运算分类单元(图2、图3),少于形态学分类的物种。瓦氏黄颡鱼、长须黄颡鱼、光泽黄颡鱼、乌苏里黄颡鱼、短尾拟鲿、圆尾拟鲿、白边拟鲿、粗唇拟鲿、长吻鮠9个物种被划分为同一个运算分类单元,凹尾拟鲿和切尾拟鲿被划分为同一个运算分类单元,中臀拟鲿、盎堂拟鲿和朝鲜拟鲿被划分为同一个运算分类单元,大鳍半鲿和斑点半鲿被划分为同一个运算分类单元,似威氏半鲿的S3和小头半鲿被划分为同一个运算分类单元。马拉巴尔鳠和似威氏半鲿2个物种各自分为多个运算分类单元。其余的17个物种分别划分为各自的运算分类单元。运算分类单元的划分与距离法结果大体一致,种间遗传距离较小的物种被划分为同一个运算分类单元中,种内遗传距离较大的物种分化为2个运算分类单元。

图2 ABGD划分的鲿科鱼类的操作分类单元Fig.2 Operational taxonomic units of Bagridae species defined by ABGD analysis

图3 鲿科鱼类ML系统发育树与ABGD界定的运算分类单元Fig.3 ML tree constructed based on COⅠ gene sequences and OTU grouping analysis by ABGD softwareOTU.运算分类单元;节点上的数字表示支持率,标尺代表遗传距离单位0.05;欧洲巨鲇和大口鲇为外群;黑色形状标记的表示此物种与其他物种聚在一起,绿色突出显示的表示几个物种归为1个运算分类单元,蓝色突出显示表示1个物种分化为多个运算分类单元.OTU. operational taxonomic unit; The values at the node were the bootstrap supporting; scale bar indicated the genetic distance; Silurus glanis and S. meridionalis was the outgroup; the black graphic marker represented the samples of species were converged to the sample of other species; the highlighted clusters in green indicated several species being categorized as one OTU, and the highlighted clusters in blue indicated one species being separated into several OTUs.

以欧洲巨鲇和大口鲇作为外群时,整个鲿科鱼类形成1个单系群(图3)。鲿科5个属形成3个大的分支:分支Ⅰ包含黄颡鱼属、拟鲿属和属,这3个属不能分别形成单系,而是个体之间相互混杂在一起,形成1大支;分支Ⅱ主要为半鲿属鱼类,但其中含有鳠属的1个物种恒河鳠;分支Ⅲ主要为鳠属鱼类,但其中含有半鲿属的1个物种丝鳍半鲿,表明半鲿属与鳠属之间存在不完全的谱系分选。

3 讨 论

3.1 DNA条形码在鲿科鱼类鉴定中的适用性

不同物种的种间和种内遗传距离大小是物种鉴定的重要判别标准,当种间最小变异超过种内最大变异时,可以有效区分物种[22]。本研究中,鲿科鱼类的种内平均遗传距离为0.016,种间平均遗传距离为0.158, 种间平均遗传距离是种内平均遗传距离的9.875倍,大多数鲿科物种的最小种间遗传距离大于最大种内遗传距离,这些物种可以通过DNA条形码进行有效识别。鲿科鱼类最大种内遗传距离大于最小种间遗传距离的7个物种不能形成条码间隙,同样,聚类树中这些物种不能形成单系群,运算分类单元分析也表明这些物种不能形成各自的运算分类单元,因此,对这些遗传上密切相关的鲿科物种进行条形码鉴定存在局限性。

种内遗传距离最大的是似威氏半鲿,如此大的种内遗传距离是由该物种的样本S3造成的。S3与S1之间的遗传距离为0.183,S3与S2之间的遗传距离为0.192,S3可能被错误地识别为似威氏半鲿。马拉巴尔鳠的种内最大遗传距离达到0.122,聚类树和运算分类单元结果均显示,马拉巴尔鳠分化为2个明显的分支,2个分支内的遗传距离比较小(0～0.004),而2个分支间的遗传距离比较大(0.117～0.122),这可能是隐存种的信号[23],由于隐存种形态十分相似,根据外部特征不能把它们区分开来,但在分子水平上表现出异质性[24-25],因此条形码相对于传统生物鉴定的优势在于可以揭示隐存种的存在。长须黄颡鱼、光泽黄颡鱼、切尾拟鲿、圆尾拟鲿、白边拟鲿、粗唇拟鲿种内与种间遗传距离有一定的重叠,可能是由这些物种间的遗传变异较小造成的,聚类树也揭示了这些物种聚在一起,可以用快速物种形成事件来解释,原因可能是黄颡鱼属、拟鲿属某些现存物种是在过去短时间内快速分化而来的,这些物种可能还没有积累足够多的碱基变异[26-27]。

3.2 鲿科鱼类系统进化的DNA条形码分析

彭作刚等[16]认为半鲿属是单系群,而曾庆等[29,31]认为半鲿属是非单系类群,为多源起源类群。本研究结果显示,8种半鲿属鱼类聚在一起,但丝鳍半鲿却与鳠属鱼类聚在一起,本研究结果支持半鲿属为非单系起源类群。《四川鱼类志》[18]将大鳍半鲿和斑点半鲿归为鳠属,而陈海港等[32]随后将其归于半鲿属。本研究中,这2个物种与半鲿属鱼类聚成一支,因此笔者认为它们应该归属于半鲿属,有效名称应为Hemibagrusmacropterus、Hemibagrusguttatus。de Pinna等[7,32]认为,鳠属为单系类群,但曾庆等[29,31]认为鳠属为非单系类群。本研究中,恒河鳠与半鲿属鱼类聚在一起,因此,笔者认为鳠属并非单系类群,半鲿属与鳠属之间存在不完全的谱系分选现象。

4 结 论

本研究中,大部分鲿科物种可以形成条码间隙,基于COⅠ基因的DNA条形码可以有效识别这些物种,但对一些近缘种,条形码鉴定存在局限性。此外,笔者也进行了鲿科鱼类系统进化分析,黄颡鱼属、拟鲿属和属的鱼类聚成1个大的单系群,支持将这3个属合并为1个属。半鲿属和鳠属并非单系类群,这2个属之间存在不完全的谱系分选现象。鲿科在属的划分上一直比较混乱,可能是选取了不恰当的形态特征作为分类依据。因此,对鲿科鱼类近缘种及分类关系混乱的物种,有待根据形态及DNA条形码和多种分子标记辅助鉴定进行系统而详细的修订。