高效液相色谱法同时测定追风透骨丸中龙胆苦苷和芍药苷含量*

2023-07-14陈丽斯彭红英唐冬兰苏锐辉汤迎湛曾利杰

中国药业 2023年13期

江涛，陈丽斯，彭红英，唐冬兰，曾晨，苏锐辉，汤迎湛，曾利杰

（广州白云山敬修堂药业股份有限公司，广东广州 510130）

追风透骨丸由制川乌、香附（制）、川芎、制草乌、麻黄、秦艽、赤芍、天麻、防风等23 味中药材组方，具有祛风除湿、通经活络、散寒止痛功效，用于治疗风寒湿痹、肢节疼痛、肢体麻木。质量标准收载于2020 年版《中国药典（一部）》［1］，但含量测定项仅测定芍药苷的含量。对于含23味中药材的成方制剂，该质量标准较简单，检测指标较局限，无法全面控制产品质量。秦艽为方中臣药，始见于《神农本草经》［2］，具有祛风湿、清湿热、止痹痛、退虚热的功效［3-6］，主要活性成分龙胆苦苷具有抗炎、镇痛等药理作用［7-12］。中药方剂由多味中药组成，共同发挥治疗作用［13］，强调从整体上发挥作用，仅靠单一成分的检测不能反映药品实际质量。多指标成分质量控制模式已广泛应用于中药及中药制剂，尤其是中成药复方制剂［14］。为保证药品质量的稳定、均一、可控，本研究中建立了同时测定追风透骨丸中龙胆苦苷和芍药苷2种活性成分含量的高效液相色谱法，以完善其质量控制标准。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 1260 型高效液相色谱仪（美国Agilent 公司），配有G1311C 型四元梯度泵、G1322A 型在线真空脱气机、G1329B 型自动进样器、G1316A 型柱温箱、G1315D 型二极管阵列检测器（DAD）、Agilent Technologies 色谱工作站；KQ-600DE 型数控超声波清洗仪（昆山市超声仪器有限公司，功率为480 W，频率为40 kHz）；XA105 型电子分析天平（精度为十万分之一），ME204T型电子分析天平（精度为万分之一），均购自瑞士Mettler-Toledo公司。

1.2 试药

龙胆苦苷对照品（批号为110770-201716，含量为97.6%），芍药苷对照品（批号为110736-201539，含量为96.4%），均购自中国食品药品检定研究院；追风透骨丸（广州白云山敬修堂药业股份有限公司，批号分别为A11063，A11064，A11065，A11066，A11067，A11068，A11069，A11070，A11071，A12072，A12073，A12074）；甲醇、磷酸均为色谱纯，水为超纯水，其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱：Agilent Eclipse Plus C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇- 0.1%磷酸溶液（30∶70，V/V）；流速：1.0 mL/min；检测波长：230 nm；柱温：30 ℃；进样量：10 μL。在此色谱条件下，龙胆苦苷峰和芍药苷峰的分离度均大于1.5。

2.2 溶液制备

分别取龙胆苦苷对照品、芍药苷对照品各适量，精密称定，加60%甲醇制成每1 mL 含龙胆苦苷和芍药苷各40 μg 的混合溶液，即得混合对照品溶液。取样品适量，研成细粉，过65 目筛，取1.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入60%甲醇25 mL，称定质量，超声处理（功率为480 W，频率为40 kHz）30 min，放冷，再称定质量，用60%甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。按处方和生产工艺分别制备缺秦艽、缺赤芍、缺秦艽和赤芍的阴性样品，按供试品溶液制备方法制备阴性对照品溶液。

2.3 方法学考察

专属性试验：分别精密吸取2.2项下3种溶液各10 μL，按2.1 项下色谱条件进样测定，记录色谱图。结果供试品溶液色谱中，在与混合对照品溶液色谱相同保留时间处有相应色谱峰，且阴性对照无干扰，表明方法专属性良好。色谱图见图1。

1. 龙胆苦苷 2. 芍药苷A. 混合对照品溶液 B. 供试品溶液 C-E. 阴性对照品溶液（分别缺秦艽、赤芍、秦艽和赤芍）图1 高效液相色谱图1.Gentiopicroside 2.PaeoniflorinA.Mixed reference solution B.Test solution C - E.Negative reference solution（lacking Gentianae Macrophyllae Radix alone，Paeoniae Radix Rubra alone，both Gentianae Macrophyllae Radix and Paeoniae Radix Rubra，respectively）Fig.1 HPLC chromatograms

线性关系考察：取龙胆苦苷对照品和芍药苷对照品各20 mg，精密称定，置同一50 mL 容量瓶中，加60%甲醇溶解并定容，作为对照品贮备液，分别精密吸取上述对照品贮备液1，2，3，5，7，10 mL，置25 mL容量瓶中，加60%甲醇定容，摇匀，配制成系列混合对照品溶液，按2.1 项下色谱条件进样测定，以对照品溶液质量浓度（X，μg/ mL）为横坐标、峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归，得回归方程为Y龙= 16.837X龙- 1.848 8（r=0.999 9，n=6），Y芍=26.624X芍+10.640（r=0.999 9，n= 6）。结果表明，龙胆苦苷、芍药苷质量浓度分别在15.718～157.175 μg/ mL 和16.095～160.949 μg/ mL范围内与峰面积线性关系良好。

精密度试验：取2.2 项下对照品溶液适量，按2.1项下色谱条件连续进样测定6 次，记录峰面积。结果龙胆苦苷、芍药苷峰面积的RSD分别为0.35%和0.72%（n=6），表明仪器精密度良好。

重复性试验：取样品（批号为A11071）粉末1.0 g，精密称定，共6 份，按2.2 项下方法制备供试品溶液，按2.1 项下色谱条件进样测定，记录峰面积，并计算含量。结果龙胆苦苷、芍药苷含量的RSD分别为0.48%和0.37%（n=6），表明方法重复性良好。

稳定性试验：取重复性试验下供试品溶液适量，分别于0，2，4，6，8，12，24 h时按2.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果龙胆苦苷、芍药苷峰面积的RSD分别为0.51%和0.83%（n= 7），表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

加样回收试验：取已知含量（含龙胆苦苷0.867 mg/g、芍药苷1.225 mg/g）的样品（批号为A11071）粉末0.4，0.5，0.6 g，各3份，精密称定，分别精密加入2种对照品溶液，按2.2 项下方法制备供试品溶液，按2.1 项下色谱条件进样测定，记录峰面积，并计算加样回收率。结果见表1。

表1 加样回收试验结果（n=9）Tab.1 Results of the recovery test（n=9）

2.4 样品含量测定

取12 批样品粉末各2 份，每份1.0 g，精密称定，按2.2 项下方法制备供试品溶液，按2.1 项下色谱条件进样测定，记录峰面积，并计算样品中龙胆苦苷和芍药苷的含量。结果样品中龙胆苦苷和芍药苷的平均含量分别为0.856，1.174 mg/ g，RSD分别为5.24%，1.91%。详见表2。

表2 追风透骨丸中龙胆苦苷和芍药苷含量测定结果（mg/g，n=2）Tab.2 Results of the content determination of gentiopicroside and paeoniflorin in Zhuifeng Tougu Pills（mg/g，n=2）

3 讨论

3.1 供试品溶液制备方法选择

预试验中，供试品溶液的制备考察了超声提取和加热回流提取2种方式，并在此基础上采用三因素三水平的正交试验考察甲醇体积分数（40%，60%，90%），提取时间（15，30，45 min），溶剂体积（25，50，75 mL）对供试品溶液提取效果的影响。结果表明，加热回流提取与超声提取对含量测定结果影响不大，故选择操作方便的超声提取。正交试验结果显示，对提取得率的影响因素从大到小为甲醇体积分数＞溶剂体积＞提取时间，最佳提取条件以60%甲醇25 mL、超声提取30 min为宜。由最佳提取条件制备的供试品溶液的主峰峰面积较大，峰形较好，故最终确定2.2项下供试品溶液制备方法。

3.2 色谱条件选择

考察了甲醇与不同体积分数醋酸（0.1%，0.3%，0.5%）和不同体积分数磷酸（0.1%，0.3%，0.5%）组成的流动相，不同柱温（26，30，35 ℃），不同检测波长（230，254 nm），不同品牌色谱柱［Thermo Scientific ODS - 2 HYPERSIL C18柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm），Phenomenex synergi C18柱（250 mm×4.6mm，4 μm），Agilent Eclipse Plus C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）］等对供试品溶液色谱峰分离效果的影响。结果表明，以2.1 项下色谱条件进样测定时，龙胆苦苷和芍药苷色谱峰峰形均良好，主峰与相邻杂质峰的分离度均大于1.5。

3.3 结果分析

本研究中测定了12 批样品中龙胆苦苷、芍药苷2 种成分的含量，结果表明，各批样品中龙胆苦苷含量差异相对较大（RSD= 5.24%），芍药苷含量差异较小（RSD=1.91%），究其原因可能为不同批次秦艽的质量差异导致。中药材质量的影响因素较多，自然环境因素与人工干预因素如土壤、光照、环境温度、降水量、农艺措施、采收时间、药材初加工、储运方式、药材掺假等对中药材品质的影响最大［15］。故制订追风透骨丸中2 种指标成分的合理限度时仍需参考更多批次样品的含量测定数据及药品的稳定性试验考察数据。