L-精氨酸快速定量检测方法的研究

吕志飞 王松江 郭传庄 隋松森 李小双 连 战 孙瑞成 王建彬

（诸城东晓生物科技有限公司，山东 潍坊 261000）

L-精氨酸是动物营养中一种关键的功能性必需氨基酸[1]，能够促进动物机体生长、增强动物机体免疫、提高动物机体繁殖性能和生产性能，在促进动物生产绿色健康发展中发挥着重要作用[2]。L-精氨酸是新生哺乳动物和家禽维持最佳生长的必需氨基酸[3]，动物饲粮中添加适量的L-精氨酸能够降低料重比，提高平均日增重[4-6]。Yao 等[7]研究表明，仔猪饲粮中添加1%精氨酸能够促进小肠吸收营养及仔猪肠道的生长发育，从而使仔猪生长性能达到最佳。L-精氨酸主要通过“精氨酸酶”和“一氧化氮”两条途径调节动物机体免疫平衡[8]，提高免疫力与幼龄动物存活率[9]。此外，在饲粮中添加适量L-精氨酸可以有效增强哺乳动物的繁殖性能[10]，提高胚胎存活率，调节母畜生殖道内环境酸碱度，在不影响受胎率的情况下提高产母犊率[11-12]。L-精氨酸在动物生产中的广泛应用，对提高饲料利用率和畜禽产品质量、降低养殖成本、提升效益大有裨益。

目前，L-精氨酸多通过微生物发酵法生产。该方法通过严格控制发酵周期防止倒酸，保证产酸水平，因此，要求L-精氨酸的含量检测必须高效准确。高效的检测方法有助于L-精氨酸稳定生产，从而降低饲料中添加L-精氨酸的高昂成本，助力养殖业降本增效。L-精氨酸检测方法主要包括氨基酸分析仪法、液相色谱分析法、酶法与坂口试剂法。氨基酸分析仪维护成本高，操作要求严格；液相色谱法设备成本高，检测周期长，仅4 ℃沉降就需要2～3 h[13-14]；酶法需要制备丙酮干粉，制备时间长达40 h，检测效率较低[15]。

本研究通过对坂口试剂改良法进行检测参数优化、准确度验证，保证L-精氨酸检测的准确、高效，以期通过L-精氨酸的稳产降低饲料成本，为L-精氨酸的工业化生产提供一定参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

L-精氨酸发酵液，由诸城东晓生物科技有限公司L-精氨酸生产车间提供。

1.2 试验试剂

L-精氨酸（纯度≥99%）购自合肥博美生物科技有限责任公司，双乙酰（纯度≥98%）购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；8-羟基喹啉、正丙醇、氢氧化钠、分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司。

1.3 主要仪器设备

5804R 高速离心机购自德国艾本德股份公司，PL1502E 电子天平购自梅特勒-托利多国际有限公司，ZWY-110X50 恒温培养振荡器购自上海智城分析仪器制造有限公司；L5S 紫外可见分光光度计购自上海仪电分析仪器有限公司；Spectronic200 可见分光光度计购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司；UV-5500PC紫外可见分光光度计购自上海元析仪器有限公司；L-8900全自动氨基酸分析仪购自株式会社日立制作所。

1.4 试验方法

1.4.1 显色液

取5 g 8-羟基喹啉加1%双乙酰水溶液2.5 mL，使用正丙醇定容至100 mL。

1.4.2 标品

称取1 gL-精氨酸标品加去离子水定容至100 mL，得到1%L-精氨酸标准溶液。使用移液管移取1%L-精氨酸标准溶液1 mL定容至100 mL，得到0.10 g/L的L-精氨酸标准溶液，即为标品。

1.4.3 发酵液前处理

发酵液离心取上清液，用去离子水稀释至L-精氨酸含量1%左右，准确移取1 mL定容至100 mL，即为样品。

1.4.4L-精氨酸含量测定步骤

根据需要准备10 mL 具塞试管，做好标记。准确移取7 mL 17.1 g/L 氢氧化钠溶液于每支试管中。分别移取标品、样品和纯水（空白）1 mL于对应的试管中，在每支试管中加入2 mL 混合显色剂，混匀，在30 ℃左右的水浴锅中放置20 min充分显色，在520 nm分光光度计下测定OD520nm值。

1.4.5L-精氨酸含量的计算

L-精氨酸(%)=(样品OD/标品OD)×稀释倍数(1)

1.4.6L-精氨酸标准曲线

配制0.2 g/L的L-精氨酸水溶液作为母液，稀释获得质量浓度为0.04、0.08、0.10、0.12、0.16 g/L 的L-精氨酸水溶液，其中0.10 g/L 的L-精氨酸水溶液为标品。按照L-精氨酸含量测定步骤加样、显色，测定吸光度，绘制L-精氨酸标准曲线。

1.5 数据统计与分析

采用Excel 进行数据处理并计算标准偏差，采用Origin pro 2017进行数据分析及图形绘制。

2 结果与分析

2.1 检测参数的确定

2.1.1 分光光度计的选择

为排除仪器误差对L-精氨酸含量测定结果的影响，分别选用3 台不同厂家、型号的分光光度计对同一样品进行测定。结果表明，分光光度计L5S、Spectronic200、UV-5500PC 测得的L-精氨酸含量分别为50.82、50.71、50.75 g/L。由此可知，坂口试剂改良法对分光光度计的选择性不高，可适用于工业生产。

2.1.2 检测波长的确定

反应液的紫外分光光度计扫描结果见图1。

图1 反应液的紫外分光光度计扫描结果

L-精氨酸侧链胍基在碱性介质中与显色液发生反应生成红色物质，该物质的吸光度在一定范围内与L-精氨酸浓度呈线性关系。本试验用L5S 紫外可见分光光度计对生成的红色反应液进行扫描。由图1 可知，525 nm 处的吸光度最大。因此，以525 nm作为L-精氨酸检测的最适波长。

2.1.3 显色时间与显色反应稳定性（见图2、图3）

图2 反应液的动力学测量结果（显色20 min）

图3 反应液的动力学测量结果（显色30 min）

试验过程中发现，显色时间对反应液的吸光度有一定影响。因此，为探究显色反应的稳定性，将同一浓度的L-精氨酸溶液分别显色20、30 min 后，用L5S 分光光度计对反应液进行动力学测量，观察反应液吸光度随时间变化的情况。

由图2 可知，样品水浴显色20 min 后直接测吸光度时，此时吸光度未达到最大值，显色不完全。

由图3 可知，样品水浴显色30 min 后直接测吸光度时，吸光度达到最大值，显色完全，且吸光度在10 min内保持不变。对比图2、图3可知，水浴显色30 min后取出样品，并在10 min 内完成吸光度的测定，更有利于保证L-精氨酸在实际测定过程中测量结果的准确性。

2.1.4L-精氨酸标准曲线（见图4）

图4 L-精氨酸标准曲线

在检测波长525 nm，水浴显色30 min 的条件下绘制L-精氨酸的标准曲线。由图4 可知，L-精氨酸的标准曲线为y=6.456 4x，L-精氨酸在该范围内线性关系良好，R2=0.999 8。

2.2 不同因素对L-精氨酸含量测定的影响

2.2.1L-赖氨酸的存在对L-精氨酸含量测定的影响（见表1）

表1 L-赖氨酸对L-精氨酸含量测定的影响（n=3）单位：g/L

研究表明，L-赖氨酸为L-精氨酸发酵中最主要的副产物。在L-精氨酸工业生产过程中，L-赖氨酸浓度可达10 g/L[16]。为探究L-赖氨酸的存在对L-精氨酸含量测定的影响，分别配制L-精氨酸溶液、L-赖氨酸溶液、相同浓度的L-精氨酸和L-赖氨酸的混合液，测定3种溶液的L-赖氨酸、L-精氨酸含量。结果表明，发酵液中L-赖氨酸的存在对L-精氨酸含量的测定结果无干扰。

2.2.2 不同pH值对L-精氨酸含量测定的影响（见表2）在L-精氨酸的发酵与后提取过程中，L-精氨酸溶液的pH 值会因酸、碱的加入产生变化。为探究不同pH 值对L-精氨酸含量测定的影响，调节L-精氨酸溶液pH 值至设定值，测定L-精氨酸含量。由表2可知，不同pH值的L-精氨酸溶液中，L-精氨酸含量标准偏差为0.047。因此，L-精氨酸生产过程中，pH 值的变化对L-精氨酸含量的测定结果无干扰。

表2 pH值的不同对L-精氨酸含量测定的影响（n=3）

2.2.3 发酵液成分对L-精氨酸含量测定的影响（见表3）

表3 样品加标回收结果（n=3）

L-精氨酸生产过程往往采取流加葡萄糖与硫酸铵的方式提高发酵水平，大量的葡萄糖、硫酸铵等物质对显色反应影响尚不明确。故通过加标回收的方法验证发酵液成分对L-精氨酸含量测定的影响。考虑不同发酵阶段发酵液组分存在差异，选择发酵初始阶段（发酵12 h）和下罐（发酵59 h）两个时间点的发酵上清液/上清稀释液分别重复本实验，验证发酵液成分对L-精氨酸含量测定的影响。由表3 可知，测得样品的加标回收率分别为99.20%、100.60%。由此可知，发酵液成分对L-精氨酸含量测定结果影响极小。

2.3 方法的可靠性

2.3.1 检测方法的重现性（见表4）

表4 检测方法的重现性

方法的重现性能够很好地检验方法的可行性。为探究本检测方法的重现性，重复标准曲线的制作过程。根据各批次绘制的标准曲线斜率计算出标准偏差为0.012，实验结果表明，该方法的重现性良好，可以用于L-精氨酸的定量检测。

2.3.2 不同化验员操作平行性（见表5）

表5 不同化验员操作平行性（n=3）

4位化验员采用不同的分光光度计，分别对4个时间点的发酵液进行L-精氨酸含量的测定。由表5 可知，L-精氨酸含量测定方法的操作平行性良好。

2.3.3 检测方法的准确性（见表6）

表6 检测方法的准确性（n=3） 单位：g/L

取3 份样液，分别用本研究优化后的坂口试剂改良法和全自动氨基酸分析仪进行定量检测。由表6 可知，本文方法定量测定L-精氨酸的结果较准确。

3 讨论

本研究对坂口试剂改良法进行了检测参数的优化以及准确性的检验，建立了一种L-精氨酸快速定量检测方法。与其他方法相比，本检测方法的优势为所用设备均为实验室常用设备，对分光光度计的选择性不高，检测成本低廉、适用性强。与郝刚等[17]研究结果相比，本方法测定不依赖标准曲线，且在实际检测过程中可通过不同规格的容量瓶进行稀释，简化了样品的前处理过程，检测效率更高；与李炜等[15]提出的检测方法相比，本研究检测过程显色更完全，吸光度更稳定，在实际生产中同时检测多个样品时能够最大限度地保证检测结果的准确性。本方法操作简便易行，化验员可熟练掌握，不同化验员检测的相对标准偏差均小于0.4%，适宜推广使用。

4 结论

本研究对坂口试剂改良法测定L-精氨酸含量的条件进行优化与验证，结果表明，该方法在0～0.2 g/L 范围内线性关系良好，相关系数为0.999 8。加标回收率范围为99.20%～100.60%，标准偏差为0.012，小于0.05，满足化学分析法的要求。本研究测定方法测得结果与全自动氨基酸分析仪测得结果差距较小，可准确测定L-精氨酸含量。该方法的优化与验证为L-精氨酸产业提供了一种快速高效的L-精氨酸检测方法，也为其他氨基酸的快速定量检测方法的选择与优化提供了参考。