外周血NLRP3 mRNA、NF-κB、PCT水平与COPD患者肺功能及肺动脉高压的关系*

张育泉, 程义局, 杜娟, 李瑞雪, 潘琳, 杨文婷, 吴潇, 卢琴, 李向魁

(1.贵州医科大学附属医院 呼吸与危重症医学科, 贵州 贵阳 550004; 2.贵阳市公共卫生救治中心 呼吸与危重症医学科, 贵州 贵阳 550004; 3.贵州医科大学 研究生院, 贵州 贵阳 550004)

慢性阻塞性肺病(chronic obstructive pulmonary disease,COPD)是呼吸与危重症科较常见的疾病之一[1-2],是一种以气流受限逐渐加重为特征、并且气流受限不能逆转的慢性疾病[3-5]。COPD在老年人群中多见,受凉感冒后加重,发病后主要表现为明显的喘息、间断地咳嗽及多咳白色泡沫痰等症状,常伴随有口唇紫绀、一定程度的呼吸困难[6-7]。目前在临床上对于COPD疾病的检测主要为肺功能及肺部CT,然而这两种评估方式对COPD气管插管病人不方便[7]。现有研究表明,炎症因子NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3信使RNA(NOD-like receptor protein 3 mRNA,NLRP3 mRNA)、核因子激活的B细胞的κ-轻链增强(nuclear factor-kappaB,NF-κB)、降钙素原(procalcitonin,PCT)与COPD相关[8-9],但尚未表明它们与COPD肺功能及肺动脉高压的关系。因此本研究拟探讨 COPD患者NLRP3 mRNA、NF-κB及PCT表达与肺功能及肺动脉高压的关系,现将结果汇报如下。

1 对象与方法

1.1 研究对象

选择2020年5月—2021年5月COPD稳定期患者和COPD急性加重期(acute exacerbation of COPD,AECOPD)未合并肺动脉高压患者,要求符合COPD相关诊断标准[10]且依据胸部CT、临床表现及肺功能检查确诊为COPD和AECOPD,近2个月内未使用过糖皮质激素、非甾体抗炎药治疗,患者均自愿参加;排除肿瘤、肺结核合并细菌感染、支气管扩张并感染、急性支气管哮喘发作、肺间质性疾病等呼吸道疾病,排除合并严重皮肤感染、肾脏病、心力衰竭。共纳入COPD稳定期患者47例和AECOPD未合并肺动脉高压患者47例,分别作为COPD 稳定期组和AECOPD未合并肺动脉高压组,COPD稳定期组中男25例、女22例,年龄47～75岁、平均(55.2±6.41)岁;AECOPD未合并肺动脉高压组中男25例、女22例,年龄47～83岁、平均(56±6.5)岁。选择同期体检健康人群为对照组,要求肺功能无异常,既往无肾、肝、心、肺疾病,纳入对照组受检者47例,男23例、女24例,年龄46 ～78 岁、平均(54.8±5.32)岁;选择同期呼吸危重症科住院的AECOPD合并肺动脉高压患者作为AECOPD合并肺动脉高压组(n=47),要求肺动脉高压为平均肺动脉压(mean pulmonary arterial pressure,mPAP)≥20 mmHg[11],其中男23例、女24例,年龄48～76岁、平均(55.26±5.2)岁。本研究取得患者的知情同意并获医院伦理委员会批准(2022伦审第498号)。

1.2 实验方法

1.2.1酶联免疫吸附法检测患者血清NF-κB、PCT表达 抽取4组受检者清晨空腹静脉血11 mL抗凝,2 ℃冷冻离心机(美国Beckman)中1 220 r/min离心7 min,吸管吸取上层血浆装于经紫外照射的塑料管中,-82 ℃冰箱保存;采用酶联免疫吸附法检测各组受检者血浆NF-κB和PCT,CMax Plus 酶标仪(上海美谷分子仪器有限公司)测光密度(optical density,OD)值,并进行比较。

1.2.2测外周血淋巴细胞NLRP3 mRNA 采集4组受检者清晨外周静脉血7 mL抗凝后储存于-80 ℃冰箱,使用磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline,PBS)稀释加人外周血淋巴细胞分离液(北京索莱宝科技有限公司)7 mL,2 000 r/min离心23 min,吸取白膜层;PBS冲洗,1 000 r/min离心11 min,弃上清液,重复2次;加 Trizol 试剂(上海生工公司)1 mL反复吹打混匀,加三氯甲烷、异丙醇等分离出mRNA;紫外分光光度(Biorad)测定仪加RNA 1 μL测量浓度与纯度;取 RNA 3.1～5.2 μL按TaKaRa生产的cDNA逆转录试剂盒加入各成分;逆转录反应条件为37 ℃ 14 min、85 ℃ 6 s 、4 ℃ 32 min,前向引物为AGGGATGAGAGTGTTGTGTGAAACG,反向引物为GCTTCTGGTTGCTGCTGAGGAC;根据2×SYBR Green qPCR Master Mix(武汉赛维尔生物科技有限公司)加含互补DNA的反应体系20 μL,设立4个复孔,反应条件为95 ℃ 30 s预变性(1 个循环),95 ℃ 15 s、60 ℃ 30 s(共41 个循环);反应1.5 h,生成单峰溶解曲线和扩增曲线,由 2-ΔΔCt表示NLRP3 mRNA 表达的高低。

1.2.3肺功能检测 对照组、 COPD稳定期患者和AECOPD未合并肺动脉高压患者吸入沙丁胺醇,采用肺功能仪检测肺功能,记录第一秒用力呼气容积(forced expiratory volume in the first second,FEV1)、用力肺活量(forced vital capacity,FVC)、FEV1占用力肺活量的百分比(FEV1/FVC)、FEV1占预计值的百分比(FEV1%pred)指标。

1.2.4心脏功能检查 采用超声心动仪(荷兰飞利浦公司)测量AECOPD未合并肺动脉高压和AECOPD合并肺动脉高压组患者的肺动脉压、右心房径及右心室径,其中肺动脉高压的规定标准为平均肺动脉压(pulmonary arterial systolic pressure,mPASP)≥20 mmHg[11]。由心脏超声室的同1名副主任医师使用相同的心动超声仪完成。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 一般资料

对照组、COPD稳定组、AECOPD未合并肺动脉高压组及AECOPD合并肺动脉高压组受检者的年龄、性别比较,差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

2.2 血清NLRP3 mRNA、NF-κB、PCT水平及肺功能指标

对照组健康人群NLRP3 mRNA、PCT、NF-κB 表达水平较COPD稳定期组患者减少(P<0.05),COPD稳定期组患者NLRP3 mRNA、PCT、NF-κB 表达水平均较AECOPD未合并肺动脉高压组减少(P<0.05);对照组健康人群FEV1%pred、FEV1/FVC较COPD稳定期组患者高(P<0.05),COPD稳定期组患者FEV1%pred、FEV1/FVC较AECOPD未合并肺动脉高压组高(P<0.05)。见表2。

表2 对照组、COPD稳定组及AECOPD未合并肺动脉高压组受检者血浆炎症指标和肺功能指标Tab.2 Inflammatory indexes and lung function in the control group, stable COPD group, and AECOPD group without pulmonary

2.3 AECOPD患者血浆炎症指标与心脏超声指标

AECOPD合并肺动脉高压组患者血浆炎症指标PCT、NF-κB、NLRP3 mRNA和心脏超声指标右心房内径、右心室内径、mPAP水平均高于AECOPD未合并肺动脉高压组,差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 AECOPD未合并肺动脉高压组与AECOPD合并肺动脉高压组患者血浆炎症和心脏超声指标Tab.3 Comparison of inflammatory indexes and cardiac ultrasound indexes between AECOPD group and AECOPD group with pulmonary

2.4 对照组、COPD稳定组及AECOPD未合并肺动脉高压组受检者NLRP3mRNA、NF-KB、PCT与肺功能指标的相关性

相关性分析结果表明,对照组、COPD稳定组及AECOPD未合并肺动脉高压组受检者NLRP3 mRNA、NF-κB、PCT与肺功能FEV1%pred、FEV1/FVC指标呈负相关性(P<0.05)。见表4。

表4 对照组、COPD稳定组及AECOPD未合并肺动脉高压组受检者NLRP3 mRNA、NF-κB、PCT与肺功能指标的相关性Tab.4 Correlation between NLRP3 mRNA, NF-κB, PCT, and pulmonary function indexes in the control group, stable COPD group and AECOPD without pulmonary hypertension group

2.5 AECOPD患者NLRP3 mRNA、NF-κB、PCT与肺动脉高压、右心房内径、右心室内径的相关性

相关性分析结果表明,NLRP3 mRNA、NF-κB、PCT与肺动脉高压、右心房内径、右心室内径指标均呈正相关(P<0.05)。见表5。

表5 AECOPD患者NLRP3 mRNA、NF-κB、PCT与肺动脉高压、右心房内径、右心室内径的相关性Tab.5 Correlation of NLRP3 mRNA, NF-κB, PCT with pulmonary hypertension, right atrial diameter, and right ventricular diameter of patients with AECOPD

3 讨论

COPD 是发生于成人的气流受限不完全可逆的疾病,且与吸烟相关[3]。COPD 病情呈进行性加重,目前研究证实可能与基因的结构密切相关[4]。COPD患者由于肺功能明显受损导致呼吸不通畅,晚期严重影响生活质量,少数病人需长期吸氧[3]。如果单凭肺功能检查来估计AECOPD疾病变化是非常困难的,因此需研究新诊断指标。PCT由大约110个氨基酸组成,由甲状腺滤泡旁细胞合成,在细菌感染时明显增高,其水平可能与细胞因子有关[12-13];PCT是监控肺组织发生炎性反应的标记物之一,根据其检测值的不同,能够判断肺部炎性反应的大概程度[9,14]。NF-κB是一种在调控细胞因子表达的炎症网络中起关键作用的转录因子,参与低氧、紫外线辐射等炎症反应的发生。有研究表明,在脂多糖诱导炎症因子的小鼠试验中,雾化吸入新型磷酸二酯酶CHF6001干粉通过抑制NF-κB的活化来抑制白三烯B4(leukotriene B4,LTB4)的产生[15];紫花牡荆素可通过抑制NF-κB信号通路来减轻COPD大鼠气道炎症[16];COPD患者活检组织及炎症细胞中NF-B表达水平明显增加[17]。NF-κB可以介导多种炎症反应,激活白细胞介素-8(interleukin 8,IL-8),IL-8可招募中性粒细胞等[18-19]。有研究表明,小鼠体内miR-149-3p可下调整合无翼信号(wingless/integrated,Wnt1)、β-连环蛋白(β-catenin)的表达来抑制Wnt 信号通路传导[18];使用miR-149-3p抑制剂通过Wnt信号途径增加肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、IL-6、NF-κB、表面蛋白A(sufactant protein A,SP-A)及 表面蛋白D(sufactant protein,SP-D)的表达,促进小鼠炎症反应的发生[18];COPD患者分泌的环氧合酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)、IL-1β、TNF-α及NF-κB mRNA表达较正常人高,COPD患者体内NF-κB与炎症因子COX-2、IL-1β、TNF-α相关[8]。NLRP3炎性小体是细胞内多种蛋白构成的固有免疫传感器,包括NLRP3、前体含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶1(cysteinyl aspartate specific proteinase1,Caspase-1)等[20-21]。NLRP3诱导gasdermin(GSDMD)蛋白的裂解,GSDMD可促使细胞膜的破裂,导致细胞蛋白释放,最终引起炎症反应的产生[22-23];NLRP3可调控 Caspase-1、白细胞介素和其他细胞因子的活化,最终调控相关炎症反应[22-23];Nachmias等[24]研究显示,暴露在吸烟环境的A-549细胞分泌的单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemotactic protein 1,MCP-1)、IL-8、NLRP3较未暴露吸烟多,暴露在吸烟环境的COPD模型中以脂多糖处理A-549 细胞分泌MCP-1、IL-8、NLRP3较脂多糖处理A-549 细胞多;Wang等[25]研究提示在骨髓细胞上表达的触发受体(triggering receptor expressed on myeloid cells 1,TREM1)通过炎性小体介导焦亡来加重COPD;也有研究表明,尼古丁诱导支气管上皮细胞焦亡,与COPD进展有关[20]。本研究中,受检者血清PCT、NLRP3 mRNA及NF-κB水平表现为AECOPD未合并肺动脉高压组>COPD稳定期组>对照组,AECOPD未合并肺动脉高压组患者NLRP3 mRNA、PCT、NF-κB、右心房内径、右心室内径及PASP表达水平较 AECOPD合并肺动脉高压组减少,PCT、NLRP3 mRNA、NF-Bκ与肺功能FEV1%pred、FEV1/FVC呈负相关,与肺动脉高压、右心房内径、右心室内径 3个指标呈正相关。

综上所述,COPD患者PCT、NLRP3 mRNA、NF-κB与肺功能FEV1%pred、FEV1/FVC呈负相关;AECOPD患者PCT、NLRP3 mRNA、NF-κB与肺动脉高压、右心房内径、右心室内径 3个指标均呈正相关。因此可将NLRP3mRNA、NF-κB、PCT三者联合检测评估AECOPD 患者病情变化值得临床科研人员进一步探讨。