水提和醇提对智脑胶囊的指标成分含量和指纹图谱影响研究*

李 翔，汪永忠,2，韩燕全,2，杨文明

（1.安徽中医药大学第一附属医院/国家中医药管理局中药制剂三级实验室，安徽 合肥 230031；2.安徽中医药大学/中药复方安徽省重点实验室/现代药物制剂安徽省工程技术中心，安徽 合肥 230031）

近年来，随着该方临床应用患者群越来越广，简单的汤剂用药已经满足不了患者的实际需求。因此，本课题组一直希望能将该方开发成胶囊剂，以方便于临床应用，服务更多的患者。近年研究表明，智脑胶囊处方药材所含的松果菊苷、毛蕊异黄酮苷、党参炔苷、槲皮素等有效成分，均具有较好的醇溶性，鉴于智脑胶囊方一直以水煎煮汤剂形式应用于临床，若将其制备成现代制剂，则水提、醇提的差异及效果需要进一步的研究。本研究拟对该方的水提和醇提效果从指标成分和指纹图谱角度进行系统比较，以期能为该方的胶囊剂开发提供实验依据。

1 仪器与试药

1.1 主要仪器 Waters Acquity H-Class超高效液相色谱仪、Waters Acquity BEH C18色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）（美国Waters公司）；KDC-16H型离心机（科大创新股份有限公司）；BZF-6050型真空干燥箱（上海博讯实业有限公司）；DK-S24型水浴锅（上海三发仪器有限公司）；1510型酶标仪（Thermo Fisher公司）；R-1005型旋转蒸发仪（郑州长城科工贸有限公司）；ME55型十万分之一天平[梅特勒-托利（上海）有限公司]；KQ3200DB型超声仪（江苏昆山超声仪器有限公司）；0.22 μm微孔滤膜[安捷伦科技（中国）有限公司]；回流提取设备自制。

1.2 材料 党参（批号：2003051）、黄芪（批号：2005183）、黄精（批号：2006033）、肉苁蓉（批号：1912122）、郁金（批号：2004233）、石菖蒲（批号：2001292）、川芎（批号：2005281）及地龙（批号：2004221）均购自安徽普仁中药饮片有限公司，以上中药饮片经安徽中医药大学第一附属医院李立华主任中药师鉴定，均符合2020年版《中华人民共和国药典》性状鉴别项下相关标准规定。松果菊苷对照品（批号：111670-200503，质量分数：98.0%）、槲皮素对照品（批号：100081-201610，质量分数：99.1%）均购自中国药品生物制品鉴定所；毛蕊花糖苷对照品（批号：DST61276-17-3，纯度≥98%）、毛蕊异黄酮苷对照品（批号：DST171107-013，纯度≥98%）、党参炔苷对照品（批号：DST200325-035，纯度≥98%）均购自成都德思特生物技术有限公司；蒸馏水（批号：20220208）购自屈臣氏食品饮料有限公司；色谱纯甲醇（批号：22045156）、乙腈（批号：21100713）均购自TEDIA公司；分析纯乙醇（批号：20807110）购自上海润捷试剂公司。

2 方法

2.1 样品的制备

2.1.1 水提工艺样品的制备 在前期单因素试验考察的基础上，按照智脑胶囊配比，称取1倍处方量的药材，加入8倍药材量的水，浸泡30 min后大火煮沸，保持沸腾状态1 h，取出煎煮液；向药渣中加入8倍量水，煎煮40 min，合并煎煮液。减压蒸馏回收至生药溶度为1 g/mL，按此方法制得10批水提工艺样品。样品批号分别为220401、220402、220403、220404、220405、220406、220407、220408、220409和220410，以下简称S1～S10。

2.1.2 醇提工艺样品的制备 在前期单因素试验考察的基础上，按照智脑胶囊配比，称取1倍处方量的药材，加入10倍药材量的75%乙醇，浸泡30 min，加热回流提取60 min，取出煎煮液；向药渣中加入8倍量的75%乙醇，继续回流40 min，合并煎煮液。减压蒸馏回收乙醇，继续浓缩至生药浓度为1 g/mL，按此方法制得10批醇提工艺样品。样品批号分别为220411、220412、220413、220414、220415、220416、220417、220418、220419和220420，以下简称C1～C10。

2.2 供试品溶液的制备 分别精密吸取各批次水提、醇提工艺样品1 mL至10 mL容量瓶中，加入甲醇定容至10 mL，振荡混匀后静置2h，再取上清液1.5mL于2 mL EP管内，12000 r/min（离心半径为5.89 cm）离心10 min，取上清液用0.22 μm针头过滤器过滤，续滤液置于进样瓶中，备用。

也许是去年效益好的缘由，今年的园里栽了不少美人娇花，园林的负责人说，美人蕉花是鸡冠花好几倍，难怪前些年那片土慌着。给人一种园好企业兴的感觉。

2.3 混合对照品溶液的制备 分别精密称取松果菊苷对照品6.26 mg、毛蕊花糖苷对照品8.46 mg、毛蕊异黄酮苷对照品5.02 mg、党参炔苷对照品5.31 mg、槲皮素对照品5.21 mg，置于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容得各对照品母液；再分别吸取各上述各对照品母液0.5、0.5、0.1、0.1、0.1 mL，置于另一10 mL容量瓶中，加入甲醇定容，得到松果菊苷、毛蕊花糖苷、毛蕊异黄酮苷、党参炔苷、槲皮素质量浓度分别为0.313、0.423、0.050、0.053、0.052 mg/mL的混合对照品溶液。

2.4 智脑胶囊水提、醇提工艺样品的指标成分含量比较研究

2.4.1 色谱条件[8-9]Waters Acquity BEH C18色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；以乙腈为流动相A、0.05%甲酸溶液为流动相B，进行梯度洗脱，时间程序为：0～5 min，3%A～20%A，5～9 min，20%A ～30%A；9～12 min，30%A ～35%A；12～13 min，35%A ～50%A；13～18 min，50%A～55%A；18～20 min，55%A～60%A；20～22 min，60%A～100%A；流速：0.20 mL/min；柱温：30 ℃；检测波长：260 nm；进样量：2 μL。在此条件下，得混合对照品、智脑胶囊水提工艺样品、智脑胶囊醇提工艺样品的UPLC图谱。（见图1）

图1 UPLC 图

2.4.2 线性关系考察分别精密吸取混合对照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL置于10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，另取一份未稀释的混合对照品液，按照“2.4.1”项下色谱条件，测定峰面积。以松果菊苷、毛蕊花糖苷、毛蕊异黄酮苷、党参炔苷、槲皮素5种指标质量浓度为横坐标（X），以峰面积为纵坐标（Y），对数据进行统计分析并线性拟合，计算得出回归方程见表1。通过计算回归方程r值可得出，这5种指标成分的进样量与峰面积呈良好的线性关系。

表1 5 种成分回归方程

2.4.3 精密度试验 精密吸取智脑胶囊醇提C1样品溶液，按照“2.4.1”项下色谱条件进样分析，重复进样6次，结果松果菊苷、毛蕊花糖苷、毛蕊异黄酮苷、党参炔苷、槲皮素的峰面积的RSD分别为2.04%、2.76%、2.58%、1.22%、2.91%，表明仪器精密度良好。

2.4.4 稳定性考察 精密吸取智脑胶囊醇提C1样品溶液，按“2.4.1”项下色谱条件分别于0、4、8、12、16、24 h进样分析，结果松果菊苷、毛蕊花糖苷、毛蕊异黄酮苷、党参炔苷、槲皮素的峰面积的RSD分别为2.33%、2.68%、2.76%、1.21%、2.90%，表明样品的稳定性良好。

2.4.5 重复性试验 取智脑胶囊醇提C1样品溶液一定量，分为6份，按照“2.2”项下方法制备供试品溶液，按照“2.4.1”项下色谱条件进样分析，测定5种成分的峰面积，计算5种成分含量和RSD值，结果松果菊苷、毛蕊花糖苷、毛蕊异黄酮苷、党参炔苷、槲皮素平均含量分别为3.701、3.816、0.401、0.152、0.095 mg/g，RSD分别为2.07%、2.19%、2.42%、2.51%和2.85%，表明方法重复性良好。

2.4.6 加样回收率试验 取智脑胶囊醇提C1样品提取液6份，每份吸取0.5 mL，分别精密加入与供试品中指标成分含量接近的对照品溶液，加甲醇定容至10 mL，振荡混匀，静置，12 000 r/min离心10 min，使用0.22 μm的针头滤膜过滤装入进样瓶，按照“2.4.1”项下色谱条件进样分析，进样量为1 μL，计算各成分的加样回收率。加样回收率（%）=（测得量-样品中含量）/加入量×100%。结果松果菊苷、毛蕊花糖苷、毛蕊异黄酮苷、党参炔苷、槲皮素的平均加样回收率分别为97.11%、97.37%、99.35%、99.41%、98.72%；RSD分别为2.96%、2.26%、2.03%、2.47%、2.17%，表明方法准确度良好。（见表2）

表2 5 种成分加样回收率试验 （n=6）

2.4.7 智脑胶囊水提、醇提工艺样品的指标成分含量测定结果 取10批智脑方胶囊水提工艺样品溶液（S1～S10）和10批智脑方胶囊醇提工艺样品溶液（C1～C10）各1 μL，按照“2.4.1”项下色谱条件进样分析。计算5种指标物质的含量，并计算各成分的变化率。变化率=（醇提工艺平均含量-水提工艺平均含量）/水提工艺平均含量×100%。结果显示，与水提工艺样品比较，醇提工艺样品中松果菊苷、毛蕊花糖苷、毛蕊异黄酮苷、党参炔苷、槲皮素含量分别增加了42.25%、28.82%、3.52%、31.99%、130.73%。表明从指标成分含量角度来看，醇提工艺提取率优于水提工艺。（见表3～4）

表3 智脑胶囊水提工艺指标成分含量测定结果 （mg/g）

表4 智脑胶囊醇提工艺指标成分含量测定结果 （mg/g）

2.5 智脑胶囊水提、醇提工艺样品的指纹图谱比较研究[10-11]

2.5.1 精密度试验 精密吸取智脑胶囊醇提C1样品溶液1 μL，按照“2.4.1”项下色谱条件，连续进样6次。样品中主要色谱峰的保留时间和峰面积差异较小，采用“中药色谱指纹图谱相似度评价软件2004（A版）”（简称相似度评价软件，下同）计算其相似度大于0.996，表明实验精密度较好。

2.5.2 稳定性试验 精密吸取智脑胶囊醇提C1样品溶液1 μL，按“2.4.1”项下色谱条件下，分别在0、2、4、8、12、24 h进样，采集色谱图，并采用相似度评价软件计算其相似度，结果指纹图谱相似度均大于0.992，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.5.3 重复性试验 按照“2.1.2”项下醇提工艺方法制备样品，按照“2.2”项下方法平行制备6份智脑胶囊醇提工艺供试品溶液，按“2.4.1”项下色谱条件，分别进样采集图谱，并采用相似度评价软件计算其相似度，结果6份样品的相似度均大于0.990，样品处理过程的重复性较好。

2.5.4 指纹图谱测定与建立 按照“2.1.1”项下水提工艺方法和“2.1.2”项下醇提工艺方法制备样品，按照“2.2”项下方法制备智脑胶囊水提、醇提供试品溶液各10批，按“2.4.1”项下色谱条件进样测定并采集指纹图谱，利用相似度评价软件进行叠加比较，得到10批智脑胶囊水提工艺样品和10批智脑胶囊醇提工艺样品的叠加指纹图谱，通过匹配共得到智脑胶囊水提工艺样品共有色谱峰14个，智脑胶囊醇提工艺样品共有色谱峰19个，其中15～19号色谱峰主要为醇提工艺样品所有。（见图2）

图2 叠加指纹图谱

2.6 智脑胶囊水提、醇提工艺样品指纹图谱结果分析[12-13]

2.6.1 指纹图谱的直观比较与色谱峰归属 将智脑胶囊水提、醇提工艺样品指纹图谱导出，通过与混合标准品图谱对比，确定部分峰归属并进行直观分析。通过与混合对照品进行比对，指认了其中5个特征峰，分别为松果菊苷（6）、毛蕊花糖苷（7）、毛蕊异黄酮苷（8）、党参炔苷（10）、槲皮素（14），由图3智脑胶囊水提、醇提工艺样品和混合对照品图谱可知，智脑胶囊水提工艺样品（S）和智脑胶囊醇提工艺样品（C）在a和b 2个区域的色谱峰存在明显差异。尤其是b区域，智脑胶囊醇提工艺样品有5个相应值较高的色谱峰，智脑胶囊水提工艺样品则在此区域则无色谱峰，表明智脑胶囊醇提工艺样品的可检测成分数明显多于水提工艺样品。（见图3）

图3 指纹图谱

2.6.2 指纹图相似度评价 将所得的10批智脑胶囊水提工艺样品和10批智脑胶囊醇提工艺样品UPLC图谱以AIA格式依次导入“中药色谱指纹图谱相似度评价软件2004（A版）”，计算得到智脑胶囊水提和醇提工艺样品的相似度。其中智脑胶囊水提工艺样品的相似度均大于0.931，智脑胶囊醇提工艺样品的相似度均大于0.937，相似度评价结果表明同一提取方式得到的样品相似度值较好。（见表5～6）

表5 智脑胶囊水提工艺样品相似度

表6 智脑胶囊醇提工艺样品相似度

2.6.3 聚类分析和OPLS-DA分析 采用SIMCA 13.0软件对10批智脑胶囊水提工艺样品和10批智脑胶囊醇提工艺样品进行聚类分析和OPLS-DA分析。从聚类分析图可见，智脑胶囊水提工艺样品和智脑胶囊醇提工艺样品可以分别聚成两类。（见图4）OPLS-DA二维投影图可见，C1～C10被聚在1个象限内距离相近，S1～S10聚在1个象限内距离相近。聚类分析和OPLS-DA结果相互印证，表明智脑胶囊水提工艺样品和醇提工艺样品内在质量差异明显。

图4 智脑胶囊水提、醇提工艺样品聚类分析树状图

图5 智脑胶囊水提、醇提工艺样品OPLS-DA 分析图

3 讨论

阿尔茨海默病（AD）是一种慢性神经退行性疾病，也是一种老年性疾病[14]。我国人口基数庞大，随着人口老龄进程加快，AD患者数量将不断增加，预计2050年我国AD患者数量将超过两千万人[15]。因而，寻找有效的治疗药物是防治该疾病的重要手段之一。智脑胶囊前期一直以汤剂应用于临床，用于治疗阿尔茨海默病，疗效确切。课题组前期曾尝试用其水提物加工成胶囊剂，其浸膏得率达到30%以上，制成胶囊后患者日服用量过大，所以课题组一直探索其乙醇提取的合理性[16-17]，为其开发成胶囊剂奠定基础。本研究通过比较智脑胶囊水提和醇提工艺样品的指标成分含量的差异性和指纹图谱，以期能为其最终采用醇提工艺提供依据。本研究结果表明，指标成分含量和UPLC指纹图谱研究方面，醇提工艺样品指标成分含量和指纹图谱色谱峰数目明显优于水提工艺，这与文献报道的研究结果相合[18-19]，结果提示乙醇提取更有利于提高智脑胶囊有效成分的提取率。

课题组前期对智脑胶囊水提工艺和醇提工艺的主要参数如提取时间、提取次数、提取溶剂倍数、乙醇浓度等参数进行了优化[16-17]，最终采用的提取条件为优化后提取条件。指标成分含量测定和指纹图谱建立过程中，分别考察了乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸水、乙腈-0.05%甲酸水等流动相系统；考察了BEH-C18（100mm×2.1mm，1.7 μm）、Shim-packsceper C18-120（100 mm×2.1 mm，3.0 μm）和Ace Excel C18（100 mm×2.1 mm，2.0 μm）等不同品牌和型号的色谱柱；同时，对柱温、流动相洗脱速度和程序、测定波长等色谱条件进行了优化，最终优化得到本研究的样品测定条件。

本研究的不足之处是测定的5种成分只分属于智脑胶囊的肉苁蓉、黄芪和党参3味药材，另5味药材的有效成分未能在此测定条件下进行检测；此外，UPLC指纹图谱也只指认了上述的5种成分，后期考虑采用LC-MS等方法确认其更多的成分。指标成分含量和指纹图谱方面比较结果表明，智脑胶囊用75%乙醇提取较水提效果更佳，但是否最终以乙醇提取代替传统的水提工艺，还需要进行药效学实验和临床研究进一步验证[20]。